鼠抗人ctni单克隆抗体fab段基因克隆和序列分析

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1、鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因克隆和序列分析作者：李妍妍，杨笛，卞智萍，徐晋丹，陈相健，顾春荣，张寄南【摘要】目的：克隆鼠抗人cTnImAbFab段基因并进行序列分析.方法：设计扩增鼠IgG重链Fd段及κ轻链引物，从分泌cTnImAb的杂交瘤细胞中提取总RNA，RTPCR扩增，对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析.结果：重链和轻链引物分别扩增出一约700bp和800bpDNA片段.经序列分析，与已发表的鼠IgG基因序列对比，其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠IgG1Fab段特征.在GenBank登录，登录号为

2、AY484430（重链）,AY484431（轻链）;氨基酸序列登录号为AAR83243（重链）,AAR83244（轻链）.结论：本实验室获得了完整的鼠源性抗人cTnImAbFab段基因，为鼠抗人cTnI的人源化改造奠定了基础.【关键词】抗体，单克隆；基因；序列分析；血清心肌钙蛋白　　【Abstract】AIM:ToobtainthegeneofmurineanticTnIFabfragmentandanalysethenucleotideanddeducedaminoacidsequences.METHODS:ByRT

3、PCRmethod,thecDNAofanticTnImurineantibodyFabfragmentplifiedfromthehybridomacells.CloningandsubsequentsequenceanalysisoftheFabfragmented.Thededucedaminoacidsequenceate700and800basepairsplifiedusingIgGheavychainprimersandκlightchainprimers,respectively.Sequencean

4、alysisindicatedthatthededucedaminoacidsequencesinoacidpresentinthemurineIgG1Fabfragment(GenBankaccessionNOAY484430,AY484431;ProtEinBankaccessionNOAAR83243,AAR83244).CONCLUSION:ThecloningandsequencingofapletemurineanticTnIFabfragmentprovidesabasisfortheproduction

5、ofthechimericanticTnIantibody.　　【Keyonocolonal;genes;sequenceanalysis;cardiactroponinI　　0引言　　本室已有多株高特异高表达的鼠源性抗人cTnI细胞株，用来检测心肌损伤时外周血中cTnI水平高低，显示了较高的临床诊断价值［1-4］.但由于鼠源性mAb的人抗鼠抗体反应［5］，使之不能用于体内诊断及作为治疗心肌损伤的药物载体，所以必须对其进行人源化修饰，有关鼠源性抗人cTnI的人源化改造少见报道.本研究目的是将鼠源性抗cTnI抗体Fab段

6、基因克隆出来并进行序列分析，为下一步制备嵌合抗体打下基础.　　1材料和方法　　1.1材料杂交瘤细胞株1株（JS200202），大肠杆菌E.coliDH5α由本室保存.pMD18T载体购自TaKaRa公司.TaqDNA聚合酶，AMV逆转录酶（Promega公司）；IPTG(异丙基βD半乳糖苷)，XGal(5溴4氯3吲哚半乳糖苷)为上海生物工程公司产品.质粒小量抽提试剂盒为上海华舜生物工程公司产品，G03SL离心式高纯质粒大量抽提试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品.　　1．2方法　　1．2．1PCR引

7、物设计根据已发表的小鼠Fab段的Fd基因和轻链基因、FR1和第一恒定区3′端的保守的基因序列，设计扩增Fd基因和轻链基因的5′端和3′端引物.重链Fd段5′端引物：H1:5′SAKGTGCAGCTCGAGSAGTCAGGACCT3′；H2:5′GAGGTYCAGCTCGAACARTCTGGACCT3′；H3:5′CAGGTCCAACTCGAGCAGYCTGGGKCT3′；H4:5′GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGRGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA3′；轻链基因的5′端引物1：5′

8、CCTCTAGAGACATCCAGATGAMCCAGTCTCC3′；2：5′CCTCTAGAGACATYKTGCTGACYCARTCTCC3′；3：5′CCTCTAGARACATTGTRATGACMCARTCTCC3′；4：5′CCTCTAGAGACATYCAGMTGACYCAGTCTCC3′；5：5