人抗hbsag单链抗体

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　　人抗HBsAg单链抗体作者:孟艳玲，温伟红，薛茜，贾林涛，鲍炜，刘家云，任君琳，薛采芳，李英辉，王成济，杨安钢【关键词】肝炎表面抗原GeneconstructionandexpressionofhumanantiHBsAgsinglechainFvTatfusionproteininE.coli　　【Abstract】AIM:ToconstructafusiongeneofhumanantiHBsAgScFvTatandtoanalyzethebindingactivityandinternalizationofScFvTatfusionproteinafteritsexpressioninE.coli.METHODS:TersplifytheScFvgene.TheconstructionainTat.Theexpressedproteinatography.ThebindingspecificityoftheScFvTatfusionproteinedbyindirectELISAandspecificinternalizationoftheScFvTatfusionproteinedbyimmunocytochemistrystainingafterthepurifiedproteinacells.RESULTS:RestrictionendonucleasedigestionandDNAsequencingprovedthatScFvgeneedthattheexpressionproductshadantigenspecificbindingactivity.ScFvTatfusionproteinacells.CONCLUSION:TheantiHBsAgScFvTatfusionproteinexpressedinE.colicanspecificallyinternalizeintoHBsAgpositivehepatocellularcarcinomacells.　　【Keyersham公司产品；6HismAb为第四军医大学免疫学教研室制备；HRP羊抗鼠IgG为武汉博士德生物有限公司产品；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒为美国Pierce公司产品；组织化学染色试剂盒为福州迈新生物有限公司产品.　　1.2方法　　1.2.1引物的设计与合成根据已有的抗体序列,我们设计了相应的引物,分别引入了XhoⅠ与EcoRⅠ酶切位点.引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成,序列如下:5＇端引物:5＇TTTCTCGAGGAGGTGCAGCTGGTGGAG，3＇端引物:5＇TTTGAATTCTTATCGATTGATTTCCACCTT.其中横线部分分别为XhoⅠ与EcoRⅠ酶切位点，方框内为终止密码子TAA的互补序列.　　1.2.2ScFv基因重组表达载体的构建及鉴定以质粒pEGFPN3HBs11为模板进行PCR扩增，扩增片段纯化后，用XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切,连接入表达载体pTATHA中，转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆,酶切鉴定.对酶切鉴定正确的克隆进行序列测定，测序由北京赛百盛生物技术有限公司完成.测序正确的质粒命名为pTATHAHBs11.　　1.2.3ScFv融合基因的诱导表达及鉴定将鉴定正确的重组质粒pTATHAHBs11转化大肠杆菌BL21，挑取单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，次日以1∶100接种，37℃培养至A600nm达0.6左右，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导培养3h，取1mL未诱导及诱导菌液离心收集菌体，以PBS重悬，超声裂菌后离心，沉淀重悬于10mL/LTritonX100,上清和重悬后的沉淀分别加入等量2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，离心后取上清进行SDSPAGE分析，凝胶薄层扫描分析蛋白纯度.同时对表达产物进行B显色，终止反应后测定各孔450nm光吸收值.②ELISA竞争抑制实验.取纯化蛋白25μL，与25μLPBST稀释的HBsAg(10mg/L)混匀，加入HBsAg包被的ELISA板孔内，以未加HBsAg的纯化蛋白25μL（纯化蛋白25μL和25μLPBST）为对照，其余步骤同间接ELISA，共设三个复孔.在酶联仪上读取A值并计算抑制率{抑制率=〔1-A（加HBsAg）/A（未加HBsAg）〕×100}.③免疫细胞化学染色检测表达产物的特异性内化.制备HepG2.2.15和HepG2细胞爬片，加入纯化蛋白，使其终浓度为0.5mg/L,37℃孵育1h,40g/L多聚甲醛固定30min,0.1mL/LTritonX100处理，30mL/LH2O2灭活内源性过氧化物酶，再以二抗同源的正常动物血清进行封闭，依次加入一抗、生物素化的二抗和SABC复合物，DAB显色，脱水透明，封片照相.　　2结果　　2.1重组表达载体的构建及鉴定以pEGFPN3HBs11为模板，用5＇端引物和3＇端引物进行PCR，扩增出720bp左右的基因片段（Fig1），与预期大小一致.将其克隆入表达载体pTATHA，重组质粒经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示：重组质粒经XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切后，出现720bp左右的片段（Fig2），经测序证实序列与原序列完全一致，表明重组原核表达质粒构建成功，命名为pTATHAHBs11.　　2.2ScFvTat融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定120g/L的SDSPAGE结果显示，与未诱导菌相比，诱导后细菌裂解沉淀中出现Mr约为30×103的新生蛋白带，与ScFvTat融合蛋白Mr相符,光度扫描显示表达量达菌体总蛋白的28%，经olCells,2003;16(3):385-391.　　〔2〕VazquezJ,SunC,DuJ,etal.TransductionofafunctionaldomainoftheAT1receptorinneuronsbyHIVTatPTD〔J〕.Hypertension,2003;41(3Pt2):751-756.　　〔3〕VivesE,RichardJP,RispalC,etal.TATpeptideinternalization:Seekingthemechanismofentry〔J〕.CurrProteinPeptSci,2003;4(2):125-132.　　〔4〕olImmunol,2003;19(2):163-167.　　〔5〕HengBC,CaoT.Makingcellpermeableantibodies(Transbody)throughfusionofproteintransductiondomains(PTD)ent(ScFv)antibodies:Potentialadvantagesoverantibodiesexpressedent (Intrabody)〔J〕.MedHypotheses,2005;64(6):1105-1108.　　〔6〕KasuyaK,BoyerJL,TanY,etal.Passiveimmunotherapyforanthraxtoxinmediatedbyanadenovirusexpressinganantiprotectiveantigensinglechainantibody〔J〕.MolTher,2005;11(2):237-244.　　〔7〕StockesS.Theroleoftherapeuticantibodiesindrugdiscovery〔J〕.BiochemSocTrans,2003;31(2):433-436.　　〔8〕LamersCH,SleijferS,senRA,etal.AdoptiveimmunogenetherapyofcancerodifiedTlymphocytes〔J〕.JBiolRegulHomeostAgents,2004;18(2):134-140.