抗河豚毒素单链抗体的制备

《抗河豚毒素单链抗体的制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、福建农林大学硕士毕业论文摘要河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种小分子非蛋白毒素，毒性极强，人畜误食后均能致死。TTX是典型的钠离子通道抑制剂，中毒者出现肢体麻木、瘫痪等症状，严重的可导致死亡。TTX人体致死剂量约为0．5mg／70kg。缺乏简单有效的检测方法。在本研究中，我们获得了用于制备TTx检测试剂盒的基因工程单链抗体，对1vrX进行检测。TTX为小分子物质，分子量仅有319．26，本身只有反应原性，不具免疫原性。若直接以其进行动物免疫，不能产生免疫效果。将TTX与钥孔假血兰蛋白(keyholelimpethemocyanin，KL

2、H)通过化学方法连接构成具有免疫原性的完全抗原，作为小鼠免疫用抗原；将TTX与牛血清蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)通过化学方法连接，作为检测用抗原。选取6．8周龄，健康的Balb／c小鼠雌性小鼠作为免疫动物进行免疫，加强免疫数次后，测小鼠血清中anti—TTX抗体效价。当血清效价达到一定值后，取效价最高的小鼠，处死后提取脾脏总RNA。提取的RNA经检测后，通过RT-PCR获得eDNA第一链。以上述cDNA为模板，经PCR得到抗体重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL，以编码(Gly4Ser)3的核苷酸序列作为linker，通过交错

3、延伸PCR将VH和VL基因组装为完整的scFv基因。将scFv基因克隆入噬菌体载体pCANTAB．5E中，构建了噬菌体单链抗体库。经过6轮淘选，最终从噬菌体抗体库中筛选到一株亲和力较高的单链抗体、VY5。关键词g河豚毒素RT-PCR单链抗体噬菌体展示ELISA福建农林大学硕士毕业论文AbstractTetrodotoxin(tetrodotoxin,TT)()，asmallmolecule，non—protein,highlytoxictoxin,cancausehumanbeingsandanimalsdeadifitiseatenbymistake

4、．TTXisatypicalsodiumionchannelinhibitor,canledtolimbnumbness，paralysisandothersymptoms．evenseriouslytodeath．HumanlethaldoseofTTXisaboutO．5mg／70kg,butwelacksimpleandeffectivedetectionmethodsforTTXSOfar．Inthisstudy,weobtainedgeneticallyengineeredsingle-chainantibodyagainstTTXforth

5、epreparationofTTXdetectionkit．TTX，whosemolecularweightisonly319．26，hasonlyreactivityandCannotprovokeimmunesystem．SoTTXWasconnectedtokeyholelimpethemocyaninⅨLH)bychemicalmethodtoconstructcompleteantigen,whichhadimmunogenicityandthenWasusedasantigen．TTXWasalsoconnectedtobovineseru

6、malbumin03SA)fordetection．HealthyBalb／cfemalemiceof6-8weeksagewereusedforimmunization．Afterseveraltimesstrengtheningimmune，miceserumtiterWastested．Oncetheserumtiterreachedahi．ghvalue，miceWassacrificedandtotalRNAWasextractedfromthespleens．ThefirsteDNAstrandwassynthesizedbyRT-PCRf

7、rommRNA．ThenVM(heavychainvariableregion)andVL(1ightchainvariableregion)wereobtainedfromeDNAtemplatebyPCR．Subsequently,anucleotidesequencewhichencodethesmallpeptide(GlynSe03WasusedasalinkertoconstructscFvgenebyoverlapextensionPCR．ThenscFvgeneWasclonedintothephagevectorpCANTAB一5Et

8、oconstructasingle-chainphageantibodylibrary．Aft