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《arg9-人抗hbsag单链抗体- egfp融合蛋白基因的构建、表达及活性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、Arg9/人抗HBsAg单链抗体/EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析作者：薛茜，温伟红，孟艳玲，张勇，张巍，王涛，张瑞，杨安钢【关键词】肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9【Abstract】AIM:ToconstructR9/ScFv14/EGFPfusiongenesandtoanalyzethebindingactivityofthefusionprotEinsaftertheyersplifythegenesofScFv14andR9/ScFv14.ThePCRproductsedR9/ScFv14/EGFPandScFv14/EGFPedthattheexpre
2、ssedproductshadantigenspecificbindingactivity.CONCLUSION:ThetexpressedinE.coliBL21maintainedthebindingactivitytoHBsAg.【Key～490nm的蓝光激发下发出绿色荧光，使用普通荧光显微镜即可进行观察.是近年来细胞生物领域中应用最为广泛的标记性蛋白质之一.EGFP为一种突变型GFP，所产生的荧光比野生型GFP增强，可作为标签用于检测目的蛋白及指示目的蛋白的定位.ScFv与效应分子组成的融合蛋白能否高效地内化入细胞对于其生物学功能的发挥具有非常关键的作用.Arg9是一个九聚精氨酸的短肽
3、序列，是蛋白转膜结构域（PTDs）的一种，它能够将与之融合的蛋白携带入细胞内［4］.我们将抗HBsAg的单链抗体（ScFv14）基因［5］与EGFP基因融合，并将Arg9编码序列融合到ScFv14/EGFP基因的5′端，构建带有转膜结构域Arg9的R9/ScFv14/EGFP融合蛋白基因，将它们在大肠杆菌中进行诱导表达，并对表达产物的亲和活性进行了分析.1材料和方法1.1材料含有编码人抗HBsAg单链抗体ScFv14基因的载体pUC19ScFv14、大肠杆菌E.coli.DH5α株和原核表达载体pET32a（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室构建［5］并保存）；EGFP融合蛋白表达载体pE
4、GFPN3（Clontech公司）；DNAMarker,T4DNALigase,pMD18Tvector和限制性内切酶BamHⅠ,EcoRⅠ,NotⅠ（TaKaRa公司）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海华舜公司）；D18T载体,转化E.coli.DH5α宿主菌，挑取单克隆,提取质粒进行酶切鉴定，阳性克隆命名为pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14，送北京三博远志生物技术公司测序.将测序正确的pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切，得到ScFv14和R9/ScFv14基因片段，将pEGFPN3用BamHⅠ和Not
5、Ⅰ酶切，得到EGFP基因片段.分别将ScFv14和R9/ScFv14基因与EGFP基因在16℃条件下连接4h后，再连入经EcoRⅠ和NotⅠ酶切的表达载体pET32a中，转化E.coli.DH5α后，筛选阳性克隆酶切鉴定.鉴定正确的质粒分别命名为pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP.1.2.3融合基因的诱导表达及鉴定将pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP质粒分别转化入E.coli.BL21，挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，220r/min，37℃培养过夜，次日以1∶100转接，在220r/min,
6、37℃条件下振荡培养至A600nm=0.4～0.6,加入IPTG至终浓度为1mmol/L,诱导培养3h，取1mL诱导菌液离心，收集菌体，进行SDSPAGE分析.另取5mL诱导菌液离心，收集菌体，以0.2mol/L的TrisHCl(pH=8.0)重悬，超声裂解后，离心取上清，沉淀用0.2mol/LTrisHCl(pH=7.4)重悬，取上清和沉淀进行SDSPAGE分析.1.2.4重组融合蛋白的Ab（1∶1000稀释），4℃孵育过夜，用TBST洗膜6次，每次5min,再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1h,用TBST洗膜6次，每次5min,按显影液说明加入显影液，用化学发光法进
7、行检测.1.2.5融合蛋白亲和活性的ELISA检测用5mg/LHBsAg包被ELISA板,每孔100μL,4℃过夜.加入不同稀释度的细菌裂解上清,每孔100μL,37℃孵育1h.设空白和阴性对照.洗涤后,加入鼠抗EGFPmAb（1∶1000稀释）,37℃孵育1h.洗涤后再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG,37℃孵育1h.最后各孔加入新鲜配制的ABTS显色液100μL,37℃孵育30mi
