人源抗her2单链抗体-轻链恒定区-鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定

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1、人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定【关键词】HER2；,单链抗体；,鱼精蛋白　　ConstructionandexpressionofhumanantiHER2ScFv/Ck/tPfusionproteininE.coliandidentificationofitsactivity　　【Abstract】AIM:ToconstructafusionproteingeneofhumanantiHER2ScFv/lightchainconstantregion/tr

2、uncatedprotamine(ScFv/Ck/tP)andanalyzethebindingactivityoftheexpressedprotein.METHODS:TersplifytheScFvandtheCkgene.Aftertheyinusofit,thenthefusionproteingeneScFv/Ck/tPedbycellularELISA,andtheDNAbindingabilityedbygelshiftassay.RESULTS:Restrictionendonucleased

3、igestionandDNAsequencingprovedthatScFv/Ck/tPedthatithadspecificantigenbindingactivity;gelshiftassayassuredthatithadDNAbindingability.CONCLUSION:TheScFv/Ck/tPfusionproteinexpressedinE.colicouldspeciallybindine　　【摘要】目的：构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区（Ck）/鱼精蛋白截短体(tP)

4、融合蛋白基因，在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性.方法：设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck)，连接成ScFv/Ck片段，人工合成tP序列，连接于ScFv/Ck末端，构建成ScFv/Ck/tP融合基因，将其克隆入原核表达载体pET32a后，在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达，表达产物经SDSPAGE和Ve23sFvPEIIGrBa［6］，pb3HFab15，pUC19，pET32a；大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)LysS和HER2阳性的人胃癌细胞

5、系SGC7901（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）；限制性内切酶、连接酶（日本TaKaRa公司）；IPTG（美国Promega公司）；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；HiTrapNiNTA螯合层析介质(美国Invitrogen公司)；6HismAb（德国Qiagen公司）；HRP－羊抗鼠IgG（武汉博士德生物有限公司）；ECL化学发光试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）；RPMI1640培养基（美国Gibco公司）；标准胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所

6、）.　　1.2方法　　1.2.1引物和tP编码序列寡核苷酸的设计与合成　　设计扩增ScFv基因的引物S5：5′tttgaattcgacgtccagctgacccagtct3′，S3：5′tttctcgagggagacggtgaccgtggtccc3′，在两端引物中分别引入EcoRI和XhoI酶切位点（下划线部分）.扩增Ck序列的引物Ck5：5′tttctcgagactgtggctgcaccatctgt3′，Ck3：5′ttttctagactaacactctcccctgttga3′，在两端引物中分别引入XhoI和

7、XbaI酶切位点（下划线部分）.tP编码序列寡核苷酸合成tP1：5′ctagacgcagccagagccggagcagatattaccgccagagacaaagaagtcgcagacgaaggaggcggagcgc3′，tP2：5′tgcgtcggtctcggcctcgtctataatggcggtctctgtttcttcagcgtctgcttcctccgcctcgcgccgg3′，寡核苷酸链的两端带有XbaI和NotI酶切位点的粘端序列（下划线部分），能够直接与经XbaI和NotI酶切的载体连接.引物和寡核苷酸

8、由北京奥科生物技术有限公司合成.　　1.2.2ScFv/Ck/tP融合基因重组表达载体的构建及鉴定　　分别以pCMVe23sFvPEIIGrBa和pb3HFab15质粒为模板，S5，S3和Ck5，Ck3为引物PCR扩增ScFv和Ck片段，产物经相应的酶切后，一起克隆入pUC19质粒，并进行序列测定，测序正确后的质粒命名为pUC19ScFv/Ck.将合成的两条tP编码序列寡核苷酸链缓慢退