人源抗her2单链抗体-轻链恒定区-鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定论文

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1、人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定论文王凯，温伟红，王涛，张瑞，秦炜炜，雷小英，杨安钢【关键词】HER2；,单链抗体；,鱼精蛋白ConstructionandexpressionofhumanantiHER2ScFv/Ck/tPfusionproteininE.coliandidentificationofitsactivity【Abstract】AIM:ToconstructafusionproteingeneofhumanantiHER2ScFv/lightchainco

2、nstantregion/truncatedprotamine(ScFv/Ck/tP)andanalyzethebindingactivityoftheexpressedprotein.METHODS:TersplifytheScFvandtheCkgene.Aftertheyinusofit,thenthefusionproteingeneScFv/Ck/tPedbycellularELISA,andtheDNAbindingabilityedbygelshiftassay.RESULTS:Restrictionendon

3、ucleasedigestionandDNAsequencingprovedthatScFv/Ck/tPedthatithadspecificantigenbindingactivity;gelshiftassayassuredthatithadDNAbindingability.CONCLUSION:TheScFv/Ck/tPfusionproteinexpressedinE.colicouldspeciallybindine【摘要】目的：构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区（Ck）/鱼精蛋白截短体(tP)融

4、合蛋白基因，在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性.方法：设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck).freelent，ScFv)和亲代抗体相比，具有分子小、穿透力强、免疫原性低的特点，日益成为诊断和治疗的良好导向载体［3-4］.鱼精蛋白是一种碱性蛋白，能与核酸结合［5］.鱼精蛋白截短体(truncatedprotamine，tP)是一段长22个氨基酸的短肽，它保留了富含碱性氨基酸的序列，同样具有核酸结合功能.我们将抗HER2ScFv基因和tP编码序列融合，同时为了避免ScFv和tP之

5、间空间结构的相互影响，在其间插入了一段轻链恒定区编码序列（kappalightchainconstantregion,Ck），以期获得同时具有抗原和核酸结合活性的ScFv/Ck/tP融合蛋白，核酸与该融合蛋白结合后，在其引导下，有望实现核酸的靶向输送，旨在为该ScFv在HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗的应用中奠定基础.1材料和方法1.1材料质粒pCMVe23sFvPEIIGrBa［6］，pb3HFab15，pUC19，pET32a；大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)LysS和HER2阳性的人胃癌细胞系SGC7901（第四军医

6、大学生物化学与分子生物学教研室）；限制性内切酶、连接酶（日本TaKaRa公司）；IPTG（美国Promega公司）；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；HiTrapNiNTA螯合层析介质(美国Invitrogen公司)；6HismAb（德国Qiagen公司）；HRP－羊抗鼠IgG（武汉博士德生物有限公司）；ECL化学发光试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）；RPMI1640培养基（美国Gibco公司）；标准胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所）.1.2方法1.2.1引物和tP编码序

7、列寡核苷酸的设计与合成设计扩增ScFv基因的引物S5：5′tttgaattcgacgtccagctgacccagtct3′，S3：5′tttctcgagggagacggtgaccgtggtccc3′，在两端引物中分别引入EcoRI和XhoI酶切位点（下划线部分）.扩增Ck序列的引物Ck5：5′tttctcgagactgtggctgcaccatctgt3′，Ck3：5′ttttctagactaacactctcccctgttga3′，在两端引物中分别引入XhoI和XbaI酶切位点（下划线部分）.tP编码序列寡核苷酸合成tP1：5

8、′ctagacgcagccagagccggagcagatattaccgccagagacaaagaagtcgcagacgaaggaggcggagcgc3′，tP2：5′tgcgtcggtctcggcctcgtctataatggcggtctctgtttcttcagcgtctgcttcctccg