全人源食管癌单链抗体scfv基因文库的构建

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1、全人源食管癌单链抗体scFv基因文库的构建作者：段红唐树彬,庞华,彭志平,李少林【摘要】目的制备全人源化食管癌单链抗体scFv基因文库。方法取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源，提取总RNA，用RTPCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对，以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段，再以它们为模板分别扩增VHlinker与VLlinker，用SOEPCR技术将它们拼接成scFv,再引入酶切位点SfiI和NotI，胶回收PCR产物获得scFv。将scFv基因克隆入噬菌粒载

2、体pCANTAB5E后电转入EcoliTG1。PCR法鉴定抗体基因插入率，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物。结果食管癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带；VH基因的大小约为450bp,VL基因为350bp,组装后的scFv基因约为850bp。PCR连接产物的转化效率为2×107cfu/μg，scFv的阳性插入率为91.7％(22／24)。结论食管癌相关的人源单链抗体基因文库的构建为进一步筛选单链抗体库奠定了基础。【关键词】噬菌体抗体库；单链抗体；食管癌；基因工程抗体1材料和方法1.1材料

3、总RNA抽提试剂盒（V)Ver.3.0购自大连宝生物工程有限公司、DNA100bpMarker购自上海生工生物工程技术服务有限公司,DNA纯化试剂盒(HS均购于大连宝生物公司；载体pCANTAB5E和大肠杆菌TG1均购自AmershamBiosciences公司。1.2方法1.2.1淋巴结总RNA的提取食管癌病人（重庆医科大学临床学院胸外科食管癌病人10例，手术后经病理确诊鳞癌6例，腺癌4例）手术时取癌肿周围淋巴结，无菌生理盐水漂洗后，剪成约0.3cm大小的组织块，立即放入盛有液氮的冰瓶中，取回后立即进行总RNA的提取或放入液氮中

4、保存。淋巴结的裂解及RNA的纯化按试剂盒说明操作，将获得的RNA（鳞癌和腺癌的RNA混匀后）贮存于-70℃。琼脂糖电泳判断RNA的完整性，分光光度仪测A260/A280判断RNA的纯度。1.2.2确定扩增VH和VL基因引物对引物序列中的简并符号采用IUPAC命名方式：R=A或G;。1.2.3网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对IgG特异VH和VL基因片段扩增：用扩增重链可变区和扩增轻链可变区的每一个后引物和每个前引物交叉配对（网格筛选）做PCR,然后分别将PCR产物电泳，确定扩增VH和VL基因片段的引物对。扩增重链可变区引物对

5、：HuJH3FOR：5’TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3’HuVH5aBACK：5’GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC3’扩增轻链可变区引物对：HuJк2FOR：5’ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3’HuVк5aBACK：5’GAAACGACACTCACGCAGTCTCC3’扩增VHlinker引物对：HuJH45Linker：5’AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC3’HuVH5aBACK

6、：5’GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC3’扩增VLlinker的引物对：HuJк2FOR:5’ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3’LinkerHuVк236BACK：5’GTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAgCl22μl，10×RTBuffer1μl，RNaseFreedH2O2.75μl，dNTPMixture(10mMeach)1μl，RNaseInhibitor0.25μl，OligodT–AdaptorPrimer0.5μl，RNA2μl，

7、AMVReverseTranscriptase0.5μl，总量10μl。②按以下条件进行反转录反应：42℃20min，99℃5min，5℃5min1个循环。1.2.5VH和VL基因扩增用确定好的引物对分别在PCR仪上扩增VH和VL基因片段。PCR反应B①按下列组成配制PCR反应液：重链可变区和轻链可变区分别进行：5×PCRBuffer10μl，灭菌蒸馏水27.75μl，Backprimer1μl，Forer1μl，TaKaRaExTaqTMHS0.25μl，总量40μl。②把B①的反应液加入到A②的反转录反应结束后的PCR反应管

8、中，轻轻混匀。③按以下条件进行PCR反应：94℃，2min1个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳（1.5％）纯化回收VH和VL基因片段。1.2.6scFv基因的组装VH和VL基因片