医学毕业论文全人源食管癌单链抗体scfv基因文库的构建

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1、全人源食管癌单链抗体scFv基因文库的构建姓名，2014年6月25日全人源食管癌单链抗体scFv基因文库的构建作者：段红唐树彬，庞华，彭志平，李少林【摘要】目的制备全人源化食管癌单链抗体scFv基因文库。方法取食管癌病人癌肿周闱淋巴结作为B细胞的来源，提取总RNA，用RTPCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文庠。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对，以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段，再以它们为模板分别扩增VHlinker与VLlinker，用SOEPCR技术将它们拼接成scFv，再引入酶切位点S

2、fiI和NotI，胶回收PCR产物获得scFv。将scFv基凶克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E后电转入EcoliTGl。PCR法鉴定抗体基因插入率，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克降酶切产物。结果食管癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果屮可见清晰的28S、18S条带；VH基因的大小约为450bp，VL基因为350bp，组装•的scFv基因约为850bp。PCR连接产物的转化效率为2xl07cfu/pg,scFv的阳性插入率为91.7%(22/24)。结论食管癌相关的人源单链抗体基因文库的构建为进-步筛选申链抗体

3、库奠定Y基础。【关键词】噬菌体抗体库；单链抗体；食管癌；基因工程抗体1材料和方法1.1材料总RNA抽提试剂盒(W6701)购自上海华舜生物工程有限公司、cDNA合成试剂盒RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0购H大连宝生物工程冇限公司、DNAlOObpMarker购11h海生工生物工程技术服务宥限公司，DNA纯化试剂盒(W5211)购自上海华舜生物工程冇限公司、Sfil和Notl内切酶、T4DNA连接酶、TaKaRaExTaqTMHS均购于大连宝生物公司；载体pCANTAB5E和大肠杆谢TG1均购自Amersha

4、mBiosciences公司。1.2方法1.2.1淋巴结总RNA的提取食管癌病人（蜇庆医科人学临床学院胸外科食管癌病人10例，手术后经病理确诊鳞癌6例，腺癌4例）手术吋取癌肿周鬧淋巴结，无茼生理盐水漂洗后，剪成约0.3cm大小的组织块，立即放入盛有液氮的冰瓶屮，取回后立即进行总RNA的提取或放入液氮屮保存。淋巴结的裂解及RNA的纯化按试剂盒说明操作，将获得的RNA（鱗癌和腺癌的RNA混匀后）贮存于-70°C。琼脂糖电泳判断RNA的完整性，分光光度仪测A260/A280判断RNA的纯度。1.2.2确定扩增VH和VL基因

5、引物对引物序列屮的简丼符号采用IUPAC命名方式：R=A或G;W=A或T;K=G或T;Y=C或T;S=G或C;H=A或C或T;N=A或C或G或T,引物参照文献［1，2］设计，引物委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成，为PAGE纯化产品。引物浓度的计算：PCR反应屮引物工作浓度为0.2

6、iM。1.2.3网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对IgG特异VH和VL基因片段扩增：用扩増重链可变区和扩増轻链可变区的每一个后引物和每个前引物交叉配对（M格筛选）做PCR，然后分别将PCR产物电泳，确定扩增VH和VL基因片段

7、的引物对。扩增重链可变区引物对:HuJH3FOR:5’TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3'HuVH5aBACK：GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC3’扩增轻链可变区引物对：HuJk2FOR:5’ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3'HuVK5aBACK：GAAACGACACTCACGCAGTCTCC3’扩增VHlinker引物对：HuJH45Linker:5’AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC3’HuV

8、H5aBACK：5'GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC3’扩増VLlinker的引物对：HuJk2FOR:5'ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3?LinkerHuVk236BACK：5?GTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAWRTTGTGHTGACKCAGTCTCC3’引入酶切位点的引物：HuVH5aBACKSfi:5’GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC3'HuJK2FORNo

9、t：5'GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3?1.2.4RTPCR逆转录反应以0八第~链的合成)A①按下列组成配制反转录反应液：MgC122pl,lOxRTBufferlpl,RNaseFreedH2O2.75^1,dNTPMixture(10mMeach)lgl,RNaseInh