氨基酸柱前衍生HPLC分析方法的应用-论文.pdf

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1、口腔护理用品工业第二十四卷第四册ORALCAREINDUSTRY2014年8月氨基酸柱前衍生HPLC分析方法的应用康春生于灏汪发文王辰旭田彩天(国家移动实验室研究发展与评价中心哈尔滨150036)摘要：氨基酸分析已成为当今医学和生物学领域的研究热点，在食品领域尤显突出。利用高效液相色谱分析氨基酸因其高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点，已得到快速发展，成为当今氨基酸分析的重要手段之一。介绍了以荧光胺、氯甲酸芴甲酯、邻苯二甲醛、2，4一二硝基氟苯、丹磺酰氯、异硫氰酸苯酯、6一氨基喹琳基一N一羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯等作为衍生剂的柱前衍生与HPLC分析方法的应用。关键词：氨

2、基酸衍生化色谱分离测到或者区别开来。就进行衍生的先后来说，可以1前言分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生是指样品先进由于氨基酸对人类生活的重要性，氨基酸分析行色谱分离，然后进行衍生化，再进行检测。柱后衍一直是分析领域研究的重要课题之一。目前，氨基生技术与柱前衍生技术相比有以下优点：反应重复酸的分析方法很多，主要有高效液相色谱法，毛细管性好；未被衍生的化合物若有吸收时，也可同时进行电泳法，质谱法(包括气一质谱法和液一质谱法)分离和检测。柱后衍生法仅需重现，可以使用一系等。氨基酸分析仪法是高效液相色谱法中最重要的列不同原理的检测器，但它要求反应室死体积要小，氨基酸分析方法，它操

3、作简便，无需进行柱前衍生，反应速率要快，过量试剂或试剂的水解产物可能造但是设备要求专用，因此成本较高，应用范围较窄。成干扰，通常需要特定的设备配件。由于以上的缺相较于其它方法而言，常规的高效液相色谱法点，柱前衍生越来越受到人们的重视。(HPLC)运用常规反应装置，具有高效、简便、快速、3衍生化试剂准确和价格低廉等优点，已成为一种较为理想的检测氨基酸的方法。氨基酸的衍生化试剂的种类繁多，理想的衍生根据分析时是否需要衍生，高效液相法分析氨试剂应在很短的时间内与氨基酸形成稳定的、单一基酸可以分为直接分析法和衍生分析法。的且能反映原氨基酸结构的产物，并且衍生反应必须操作简单、重

4、现性高，过量的衍生试剂应该不干扰2氨基酸色谱分析方法以后的色谱分离和检测，或者在必要的情况下很容2．1直接法易除去。常用的衍生化试剂有如下几种。直接法采用离子交换色谱的氨基酸分析仪，对3．1荧光胺氨基酸进行直接分析，不需要衍生；采用高效阴离子荧光胺，Fluorescamine(简称FA)，是苯乙醛在交换色谱积分脉冲安培检测法进行检测，不需要繁过量茚三酮的存在下迅速与氨基酸形成的强荧光产琐的衍生步骤；操作简单，灵敏度高，而且分离效果很物。荧光胺与氨基酸的反应方程式如图1所示。好。戴安公司上世纪推出的氨基酸AAA—Direct系统就是此种方法的代表，采用高效阴离子交换色谱积

5、分脉冲安培检测法(HPAEC—IPAD)。但其价格昂一。一贵，分析时间长，专一性太强，投人大，局限性明显，不利于普遍推广。这些都限制了它的应用和推广。2．2衍生法图1荧光胺与氨基酸的反应方程式由于大部分氨基酸结构简单，而且彼此比较相该试剂具有一定选择性，只与一级氨基酸反应似，大多没有发光或者发色基团，所以一般难以被检生成荧光衍生物，二级氨基酸也与其反应，但并不形2014年第4期康春生，等：氨基酸柱前衍生HPLC分析方法的应用49成荧光衍生物，对于检测一级氨基酸是一种理想的氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、牛磺酸(Tau)、甘氨酸试剂，而且该反应条件并不苛刻，反应迅速，衍

6、生试(Gly)的含量，为目前缺血性脑损伤功能障碍机理剂本身对于反应干扰小，其荧光激发波长390nm，发及健脑中药的药理研究提供了快速分析手段，为从射波长475nm。神经生化角度揭示多发梗塞性痴呆的发生机制提供3．2氯甲酸芴甲酯了有意义的线索和依据。陈飒飒以邻苯二甲醛9一fluorenylmethylchlorformate，简称FMOC—柱前衍生，ODSC18柱分离，PH6．0醋酸盐缓冲溶液cl。和氨基酸反应，既可以用作荧光检测，同时也可与甲醇二元梯度洗脱，荧光检测。结果仅在9min内以用紫外检测。荧光检测的激发波长为265nm，发就分离测定了大鼠脑中5种氨基酸介质的含

7、量。在射波长为310nm。该衍生反应迅速，衍生产物稳定，一定浓度范围内，氨基酸的峰面积与其浓度呈现良4℃下避光储存13天不受影响。但该衍生试剂的选好的线性关系，得到方法适用于神经药理学的研究，择性比较低，FMOC—C1的水解产物FMOC—OH均建立测定神经中枢氨基酸类介质的方法。有同FMOC一氨基酸类似的荧光干扰。魏京广⋯等3．42，4一二硝基氟苯以邻苯二甲醛(OPA)与氯甲酸芴甲酯(FMOC—C1)2，4一二硝基氟苯，2，4一dinitro—fluorobenzene，作衍生剂，正缬氨酸为内标，采用柱前衍生反相高效简称DNFB。DNFB