opa在线柱前衍生化hplc

《opa在线柱前衍生化hplc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、OPA在线柱前衍生化HPLC【摘要】目的建立一种新的在线柱前衍生化HPLC-FLD法测定血浆中的阿米卡星。方法血浆样品碱化后用乙腈沉淀蛋白，上清液用OPA程序在线衍生化后进样分析。色谱柱：AgilentXDB-C18(5μm，4.6mm×150mm);流动相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠(70∶30，pH=3.67);荧光检测：λex=342nm，λem=440nm;流速：1.0mL/min;柱温：40℃;样品盘温度10℃;进样量：10μL;衍生化时间：1min。结果该法测定血浆中阿米卡星定量下限为1mg/L,线性范围在1～50m

2、g/L(r=0.9993);日内、日间RSD小于11%，绝对回收率大于90%，相对回收率大于95%。结论本法准确、灵敏、易于操作，可用于阿米卡星的血药浓度测定及药动学研究。【关键词】硫酸阿米卡星;在线柱前衍生化;高效液相荧光检测法;血浆药物浓度硫酸阿米卡星(Amikacin)为半合成氨基糖苷类抗生素,对大多数氨基糖苷类钝化酶稳定，适合于治疗革兰阴性杆菌中卡那霉素、庆大霉素或妥布霉素耐药菌株所致感染。对多数肠杆菌科细菌具有良好作用,对铜绿假单胞菌具有高效，而且与其它抗生素无交叉耐药性，抗菌作用比卡那霉素强。但是阿米卡星有肾毒性、听觉器官毒

3、性和神经肌肉阻滞等毒副作用，在临床使用时，最好根据其体内血药浓度数据个体化给药，因此建立检测阿米卡星血药浓度的方法十分必要。由于阿米卡星化学结构没有强紫外吸收基团,并且血浆中阿米卡星浓度极低,紫外检测器难以检测。本实验参考有关文献[1-5]，建立在线柱前衍生化HPLC荧光检测方法，以测定人血浆中阿米卡星的浓度。　　1材料　　美国Agilent1200型高效液相色谱仪(自动进样器，四元梯度泵，可控柱温箱，荧光检测器，Chemistations化学工作站)，pHS-3B型精密pH计(上海雷磁仪器厂),TGL-20M台式高速冷冻离心机(湖南赛

4、特湘仪),梅特勒十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler公司),XH-B漩涡混合器(姜堰市康健医疗器具有限公司)。　　阿米卡星对照品(中国药品生物制品检定所，批号：130335-200204);邻苯二甲醛(o-Phthalaldehyde，OPA),Sigma公司生产，批号：2114022;甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯;水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);空白血浆(购于本院输血科)。　　2方法与结果　　2.1色谱条件色谱柱：AgilentZorbaxEcliPseXDB-C18(5μm，4.6mm×150mm);保护柱:

5、AgilentZorbaxSB-C18(5μm，12.5mm×4.6mm);流动相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠(pH=3.67)，70∶30;荧光检测：激发波长342nm，发射波长440nm;流速：1.0mL/min;柱温：40℃;样品盘温度10℃;进样量：10μL;衍生化时间：1min。　　2.2柱前程序衍生自动进样器样品盘编号：1为OPA衍生化试剂，2为色谱纯乙腈(未加盖)，3为纯水(未加盖);进样顺序：从样品盘中吸取经碱化乙腈沉淀蛋白后20μL血浆样品，从2中吸取0.0μL乙腈，从1中吸取20μLOPA硼酸盐溶液，从3中吸

6、取0.0μL纯水，空气中最大混合速度混合5次，等待1min后进样。　　2.3对照品溶液和衍生化试剂的配制精密称取阿米卡星对照品10.0mg，至10mL棕色容量瓶中，用纯化水溶解并定容至刻度，置冰箱4℃贮存备用。精密称取OPA400mg溶于8mL甲醇中，再加8mLα-巯基乙醇，用pH=10.4、0.4mol/L的硼酸缓冲液定容至100mL棕色容量瓶，临用前用0.22μm滤膜过滤，取滤液置自动进样器供衍生化。　　2.4血浆样品衍生化前处理精密量取血浆样品200μL于离心试管中，加入pH=10.38硼酸缓冲液200μL，漩涡混合后，加入乙腈4

7、00μL，旋涡振荡1min，12000r/min离心10min，吸取上清液200μL置自动进样器衍生化。　　2.5标准曲线的绘制配制阿米卡星血浆浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0mg/L，按“2.4项”下进行，然后置自动进样器按“2.3项”下所述方法操作，进行色谱分析，以浓度为横坐标，衍生化产物的峰面积为纵坐标做回归曲线，得方程：Y=89.489X-16.804，(r=0.9993,n=6)，在1.0～50mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，定量下限为1.0mg/L。　　2.6回收率与精密度试验分别配制浓度为2.

8、0、10.0、50.0mg/L阿米卡星血浆样品，按“2.4项”下处理，然后置自动进样器按“2.4项”下所述方法操作，按回归方程计算实测浓度，分别在同一天内测定5次，连续3d，结果见表1。表1阿米卡星衍生产物