柱前衍生化rp—hplc测定鸡内金中种氨基酸的含量

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1、柱前衍生化RP—HPLC测定鸡内金中16种氨基酸的含量　　[摘要]采用酸水解法制备水解氨基酸样品溶液，以异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生化后进行HPLC分析。采用UltimatePrimeC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相A0.1mol·L-1醋酸钠溶液（调pH至6.5）-乙腈（93∶7），流动相B乙腈-水（8∶2）；流速1.0mL·min-1；柱温40℃；检测波长254nm；梯度洗脱。氨基酸衍生溶液在36h内保持稳定，16种氨基酸线性相关系数均大于0.9995，加样回收率在98.01

2、%～101.8%。该方法操作简便，精密度和重复性良好，可用于鸡内金中16种水解氨基酸含量的测定。　　[关键词]鸡内金；氨基酸；衍生化；异硫氰酸苯酯；高效液相色谱　　[收稿日期]2013-10-10　　[基金项目]国家药品标准科研项目；上海市自然科学基金项目（13ZR1442000）　　[通信作者]修彦凤，副教授，E-mail：xiuyf@hotmail.com　　[作者简介]梁琨，讲师，E-mail：dolphin000000@163.com　　鸡内金为雉科动物家鸡Gallusgallusdomestic

3、usBrisson的干燥沙囊内壁。杀鸡后取出鸡肫，立即剥下内壁，洗净，干燥。鸡内金性味甘，平，归脾、胃、小肠、膀胱经。具有健胃消食、涩精止遗、通淋化石的功效，用于食积不消、呕吐泻痢、小儿疳积遗尿、遗精、石淋涩痛、胆胀胁痛。近年来，随着鸡内金在临床上的应用越来越广泛，对鸡内金的质量提出了更高的要求，而《中国药典》2010年版仅以醇溶性浸出物和灰分为指标，没有指标成分的含量测定。　　现代研究表明，鸡内金主要含有蛋白质、多种氨基酸、维生素和微量元素等。氨基酸作为蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，是

4、人体的必需营养成分之一。笔者利用PITC柱前衍生化方法针对鸡内金中16种氨基酸类成分进行了测定。　　1材料　　AgilentHPLC1100系统：四元泵、真空在线脱气机、二极管阵列检测器（DAD）、AgilentChemStation工作站；BT25S电子天平（1/10万，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；FE20pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。　　16种氨基酸对照品，批号分别为L-天冬氨酸（Asp）110103，L-谷氨酸（Glu）110109，L-丝氨酸（Ser）120116，L-甘氨酸（Gl

5、y）120301，L-组氨酸（His）120112，L-精氨酸（Arg）101201，L-苏氨酸（Thr）120113，L-丙氨酸（Ala）120117，L-脯氨酸（Pro）100311，L-酪氨酸（Tyr）120201，L-缬氨酸（Val）120113，L-蛋氨酸（Met）110125，L-异亮氨酸（Ile）110801，L-亮氨酸（Leu）120117，L-苯丙氨酸（Phe）090712，L-赖氨酸（Lys）100423，以上对照品均购自上海友思生物技术有限公司，纯度均≥98%；10批鸡内金分别购买于

6、安徽（1）、湖南（2）、浙江（3）、上海（4）、内蒙古（5）、广东（6）、江苏（7）、云南（8）、河北（9）、山东（10），由上海中医药大学修彦凤副教授鉴定为雉科动物家鸡G.gallusdomesticus的干燥沙囊内壁。　　异硫氰酸苯酯（PITC）纯度标示量为97.0%（AlphaAesar公司）；乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；醋酸钠、三乙胺、盐酸、正己烷、冰醋酸均为分析纯，购于国药集团上海公司；纯净水为Milli-Q纯水。　　2方法与结果　　2.1色谱条件及系统适用性试验　　UltimateP

7、rimeC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相A0.1mol·L-1醋酸钠溶液（以冰醋酸调pH为6.5）-乙腈（93∶7），流动相B乙腈-水（8∶2），梯度洗脱程序见表1；流速1.0mL·min-1；柱温40℃；进样量5μL；检测波长254nm。　　2.2溶液的制备及衍生化　　2.2.1混合对照品储备溶液的制备精密称取16种氨基酸对照品于量瓶中，用0.1mol·L-1盐酸溶液定容，配制成每1mL分别含L-天冬氨酸（Asp）0.3292mg，L-谷氨酸（Glu）0.3328mg，L-丝氨酸（

8、Ser）0.2620mg，L-甘氨酸（Gly）0.2836mg，L-组氨酸（His）0.3928mg，L-精氨酸（Arg）0.4380mg，L-苏氨酸（Thr）0.2916mg，L-丙氨酸（Ala）0.2244mg，L-脯氨酸（Pro）0.2932mg，L-酪氨酸（Tyr）0.4496mg，L-缬氨酸（Val）0.2904mg，L-蛋氨酸（Met）0.3688mg，L-异亮氨酸（Ile）0.3312mg，L-亮氨酸（Leu）0