opa-fmoc柱前衍生高效液相色谱法测定细胞培

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1、OPA/FMOC柱前衍生高效液相色谱法测定细胞培【摘要】目的：该实验建立了以OPA/FMOC作为柱前衍生化试剂，采用高效液相色谱法测定细胞培养基中氨基酸含量的方法。在10～180μg.mL-1范围内线性关系良好,相关系数在0.9953～1.000之间,平均回收率95.9%～102.4%,CV%<3.8%(n=5),重复性RSD为0.08%～3.82%(n=6)。结论：该方法准确、灵敏、简便快速，适用于细胞培养基中氨基酸的含量测定。【关键词】OPA/FMOC柱前衍生法；细胞培养基M199；氨基酸；高效液相色谱细胞培养基作为细胞工程重要的原材料，其质量的优劣直接影响到生物

2、制品的产量，是生物制品企业非常重视的基础原料。而所有的细胞培养基均含有氨基酸、维生素等必需的营养物质，它们是维持和促进细胞生长、增殖的主要因素。这些物质含量的多少是衡量细胞培养基能否促进细胞生长的重要指标,也是检定培养基是否符合工艺规定的质量指标。因此，确立如何测定培养基中氨基酸的含量是细胞培养基生产厂商保证产品质量的关键工作。氨基酸的分析方法在近几年已得到了很大的改进和完善，衍生化测定是氨基酸两类分析方法之一[2]。对于各种保健品及复合氨基酸制剂，目前较多的采用PICT柱前衍生试剂测定氨基酸[5][6]。PICT不仅毒性大，且需要专门的衍生装置在无水条件下进行。AQC(6

3、-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯)柱前衍生测定氨基酸可以获得较好的结果[4]，但分析时间较长，衍生试剂昂贵且不易购得。OPA和FMOC（邻苯二甲醛一氯甲酸芴甲酯）联用作为衍化试剂具有衍生反应迅速、分析周期检短、检测灵敏度高等特点，且衍生化过程完全自动化操作，使分析效率大为提高。我们使用HypersilC18分析柱，可变波长UV检测器，OPA-FMOC柱前衍生测定细胞培养基M199中氨基酸含量，自动衍生进样后经梯度洗脱可以在20min内使20种氨基酸完全分离。分离效果，重现性，线性范围均令人满意。1实验部分1.1仪器和试剂HP公司1050型高效液相色谱仪、四元梯度

4、泵、自动进样器、可变波长紫外检测器、PhoenixDos化学工作站；分析天平BS210S，赛多利斯；pHS-3C数显pH计，上海雷磁仪器厂；乙酸钠、四氢呋喃和三乙胺为分析纯；乙腈和甲醇为色谱纯；OPA10mg/ml，FMOC2.5mg/ml为HP公司产品；氨基酸对照品为sigma公司产品；细胞培养基M199为无锡市美迪生物制品有限公司产品。1.2色谱条件色谱柱：HypersilODS柱，5μm，125×4mmid；流动相：A相：取20mM乙酸钠+0.6%四氢呋喃+0.02%三乙胺，用稀醋酸调节PH至7.2。B相：100mM乙酸钠（PH7.2）∶乙腈∶甲醇=100∶175∶2

5、25；流速：1.0ml/min；洗脱梯度：0.0-17.0minA相（%）100→40、B相（%）0→60，17.0-18.0minA相（%）40→0、B相（%）60→100；柱温：40℃；波长切换：0-14.5min、338nm，14.5-20min、262nm；衍生化及进样：5.0μl硼酸盐缓冲液+1.0μlOPA液+1.0μl氨基酸液+1.0μlFMOC液按一定程序自动混匀反应后进样。1.3对照品及样品制备对照品储备液：按M199配方，分别称取各种氨基酸适量，精密称定，用水溶解并稀释至50ml作为对照品储备液。供试品溶液：虽然M199中含有61种成分，但其中可溶性无机

6、盐、葡萄糖、氨基酸占成分的98%以上，且各种难溶成分均通过不同工艺转变为可溶性物质，一些物质又极微量，所以按配制说明制成溶液后，溶液澄清，pH为7.2，可以上机直接测定。2结果与讨论2.1线性范围、标准曲线及分离图谱分别精密量取各种氨基酸对照品储备液1、2、3、4、5ml，用水稀释至100ml。按上述色谱条件测定各种氨基酸的线性范围及标准曲线。结果表明，20种氨基酸在一定浓度范围内线性关系良好。精密量取各种氨基酸对照品储备液2ml，置一100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，20种氨基酸的色谱分离结果。2.2回收率测定按细胞培养基M199配方配制试样，按上述色谱条件连续进样5次

7、，计算各氨基酸的回收率，20种氨基酸的平均回收率范围是95.9～102.4%，RSD<3.8%(n=5)。2.3重现性试验取2.1项下用于色谱分离的对照品溶液，按上述操作程序连续进样6次，对方法的重现性进行考察。结果表明，20种氨基酸的RSD为0.08%～3.82%(n=6)。2.4样品氨基酸含量测定精密称取细胞培养基M199约10g，按说明书要求配制成溶液，即为供试品溶液。根据上述色谱条件进行分离分析，经系统适用性实验各氨基酸之间的分离度应大于1.0，以天门冬氨酸计算，理论塔板数应大于3000，采用外标法，