opa-fmoc柱前衍生高效液相色谱法测定细胞培养基m199中氨基酸含量论文

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1、OPA/FMOC柱前衍生高效液相色谱法测定细胞培养基M199中氨基酸含量论文【摘要】目的：该实验建立了以OPA/FMOC作为柱前衍生化试剂，采用高效液相色谱法测定细胞培养基中氨基酸含量的方法。在10～180μg.mL-1范围内线性关系良好,.freelin内使20种氨基酸完全分离。分离效果，重现性，线性范围均令人满意。1实验部分1.1仪器和试剂HP公司1050型高效液相色谱仪、四元梯度泵、自动进样器、可变波长紫外检测器、PhoenixDos化学工作站；分析天平BS210S，赛多利斯；pHS-3C数显pH计，上海雷磁仪器厂；乙酸钠、四氢呋

2、喃和三乙胺为分析纯；乙腈和甲醇为色谱纯；OPA10mg/ml，FMOC2.5mg/ml为HP公司产品；氨基酸对照品为sigma公司产品；细胞培养基M199为无锡市美迪生物制品有限公司产品。1.2色谱条件色谱柱：HypersilODS柱，5μm，125×4mmid；流动相：A相：取20mM乙酸钠+0.6%四氢呋喃+0.02%三乙胺，用稀醋酸调节PH至7.2。B相：100mM乙酸钠（PH7.2）∶乙腈∶甲醇=100∶175∶225；流速：1.0ml/min；洗脱梯度：0.0-17.0minA相（%）100→40、B相（%）0→60，17.0

3、-18.0minA相（%）40→0、B相（%）60→100；柱温：40℃；波长切换：0-14.5min、338nm，14.5-20min、262nm；衍生化及进样：5.0μl硼酸盐缓冲液+1.0μlOPA液+1.0μl氨基酸液+1.0μlFMOC液按一定程序自动混匀反应后进样。1.3对照品及样品制备对照品储备液：按M199配方，分别称取各种氨基酸适量，精密称定，用水溶解并稀释至50ml作为对照品储备液。供试品溶液：虽然M199中含有61种成分，但其中可溶性无机盐、葡萄糖、氨基酸占成分的98%以上，且各种难溶成分均通过不同工艺转变为可溶性

4、物质，一些物质又极微量，所以按配制说明制成溶液后，溶液澄清，pH为7.2，可以上机直接测定。2结果与讨论2.1线性范围、标准曲线及分离图谱分别精密量取各种氨基酸对照品储备液1、2、3、4、5ml，用水稀释至100ml。按上述色谱条件测定各种氨基酸的线性范围及标准曲线。结果表明，20种氨基酸在一定浓度范围内线性关系良好。精密量取各种氨基酸对照品储备液2ml，置一100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，20种氨基酸的色谱分离结果。2.2回收率测定按细胞培养基M199配方配制试样，按上述色谱条件连续进样5次，计算各氨基酸的回收率，20种氨基酸的平

5、均回收率范围是95.9～102.4%，RSD3.8%(n=5)。2.3重现性试验取2.1项下用于色谱分离的对照品溶液，按上述操作程序连续进样6次，对方法的重现性进行考察。结果表明，20种氨基酸的RSD为0.08%～3.82%(n=6)。2.4样品氨基酸含量测定精密称取细胞培养基M199约10g，按说明书要求配制成溶液，即为供试品溶液。根据上述色谱条件进行分离分析，经系统适用性实验各氨基酸之间的分离度应大于1.0，以天门冬氨酸计算，理论塔板数应大于3000，采用外标法，将对照品溶液和供试品溶液分别注入色谱仪中。根据对照品溶液的浓度、峰面积

6、和供试品溶液的峰面积，计算供试品中氨基酸的含量。结果各氨基酸组分的含量均在标示量的80%～100%之间。2.5讨论本方法使用了两种衍生化试剂，可迅速衍生一级、二级氨基酸，使所有20种氨基酸均生成较强荧光和紫外吸收衍生物。自动进样器的使用，方便了衍生化步骤的操作。我们在进样时设置自动混匀程序，在抽取OPA后自动混合20次，抽取FMOC后自动混合30次，衍生化反应完全，分析效率大为提高，也减少了误差的产生。脯氨酸的最大吸收波长在262nm，在338nm处灵敏度较低，因此，我们设定在其他19个氨基酸出峰后切换波长为262nm以提高脯氨酸检测灵

7、敏度。进行梯度洗脱，加快了氨基酸出峰时间，但应注意的是两种流动相的pH需要严格控制在7.20，否则组氨酸与甘氨酸两峰易粘连，使检测误差加大。细胞培养基的型号较多，含有的氨基酸种类及质量均不相同，我们选取含氨基酸种类最多的M199作为试验对象，通过对M199中氨基酸含量检测方法的建立，也可适用于其他细胞培养基中氨基酸的检测。