家蚕孵化酶基因Ⅱ的克隆、表达及其启动子特性分析.pdf

《家蚕孵化酶基因Ⅱ的克隆、表达及其启动子特性分析.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、学校代码：10289分类号：S884家密级：公开蚕学号：092300025孵化酶基因Ⅱ的克江苏科技大学隆、表达硕士学位论文及其启动子特性分家蚕孵化酶基因Ⅱ的克隆、表达析吴俊及其启动子特性分析江苏科技大学研究生姓名吴吴吴吴俊俊俊俊导师姓名唐唐唐唐顺顺顺顺明明明明申请学位类别理学硕士理学硕士理学硕士理学硕士学位授予单位江江江江苏苏苏苏科科科科技技技技大大大大学学学学学科专业生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学论文提交日期2020201220121212年年年年6666月月月月11

2、11日日日日研究方向家蚕分子生物学家蚕分子生物学论文答辩日期2020201220121212年年年年6666月月月月1111日日日日答辩委员会主席沈沈沈沈兴兴兴兴家家家家评阅人2012年6月1日分类号：Q78密级：公开学号：092300025江苏科技大学硕士学位论文家蚕孵化酶基因Ⅱ的克隆、表达及其启动子特性分析学生姓名吴俊指导教师唐顺明副研究员江苏科技大学二O一二年六月AThesisSubmittedinFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMaster

3、ofScienceMolecularcloning,expressionandcharacterizationofhatchingenzymegeneⅡanditspromoterinthesilkworm,BombyxmoriSubmittedbyWuJunSupervisedbyTangShunmingJiangsuUniversityofScienceandTechnologyJune,2012江苏科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作

4、所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：2012年月日江苏科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印

5、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)保密□，在年解密后适用本授权书。(2)不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：2012年月日2012年月日摘要摘要孵化酶（Hatchingenzyme,HE）是动物胚胎孵化过程中消化卵壳的一类蛋白酶。本课题组业已报道了一种家蚕孵化酶样基因(BmHEL)，但经原核表达的BmHEL对家蚕卵壳降解活性较弱。在硬骨鱼中，有两种孵化酶HCE和LCE相互协作共同消化卵壳。家蚕中是否存在其它孵化酶？本研究通过生物信息学方法并结合RACE技术，成功克隆了

6、另一种家蚕孵化酶（样）基因BmHELⅡ，对之进行分子特性分析，原核表达及启动子区特性分析。这些研究结果将有助于从分子水平上进一步研究家蚕的孵化和精子发生的机制。本研究主要获得以下四部分结果：1.BmHELⅡ的克隆与分子特性分析：：：：通过生物信息学手段并结合RACE技术，我们获得了另一种家蚕孵化酶基因的全长cDNA序列(BmHELⅡ,GenBank登录号：JN627443)。BmHELⅡ全长977bp,包含一个885bp的开放阅读框，编码294个氨基酸，包括预测的16个氨基酸的信号肽和208个氨基酸

7、的成熟酶区。BmHELⅡ蛋白分子量为33.62kDa，等电点为5.44，含有虾红素家族的两个特征保守序列。生物信息学分析结果显示，BmHELⅡ蛋白序列与其它物种已经鉴定出的HE序列的蛋白酶功能区有29.5%~87.0%的同源性。BmHELⅡ基因为6-外显子-5-内含子结构。BmHELⅡ基因转录本相对表达量随着胚胎发育而上升并在孵化时达到顶峰，随后逐渐下降，其瞬时表达性基本与孵化酶基因相吻合。另外，BmHELⅡ基因转录本在家蚕五龄幼虫期到蚕蛾期精巢组织中，持续维持高水平表达，初步推测BmHELⅡ可能与

8、家蚕的精子发生相关。2.BmHELⅡ的生物学功能验证：我们将BmHELⅡORF克隆至原核表达载体pET28a，转化至大肠杆菌BL21，进行表达。融合蛋白以包涵体形式存在，含有6×His-Tag序列，可通过Ni-NTA亲和层析得以纯化，纯化后的蛋白可通过WesternBlot检测到。经纯化、复性的BmHELⅡ或BmHEL对家蚕卵壳具有一定的降解活性，但BmHELⅡ与BmHEL的混合物显示对卵壳具有更高活性，结果显示两者可能都参与了家蚕孵化过程。3.BmHEL与BmHEL