肉桂酸-4-羟化酶基因及其启动子克隆与表达分析-论文.pdf

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1、·生物技术·北方园艺2o14(18)：122～127栋肉桂酸一4一羟化酶基因及其启动子克隆与表达分析王玉珍，陈桂信。，赵利，吕恃衡，潘东明，姜翠翠。(1

2、福建农林大学园艺学院，福建福州350002；2．福建农林大学园艺产品贮运保鲜研究所，福建福州350002；3．福建省农业科学院果树研究所，福建福州350013)摘要：以不同发育时期的捺果实为试材，采用两步法逆转录与抑制PCR技术相结合的方法构建均一化全长cDNA文库，筛选出一条编码肉桂酸_4一羟化酶的全长cDNA(命名为PsC4H)；采用APA-Walking技术，分离获得该基因的启动子序列；采用实时荧光定量PCR技术，检测该基

3、因在榛果实不同发育时期的表达动态。结果表明：R(H基因全长为1772bp，ORF(()penReadingFrame)为1515bp，编码504个氨基酸，相对分子量为】45719．6，等电点为4．94，经序列同源性分析发现，PsC4H氨基酸序列与李属果树高度同源；经PlantCare软件预测，榇PH基因的启动子除具有TATA／cAAT—box~l"，还含有G-box、HSE等特异作用元件；实时荧光定量结果显示，PsC4H在捺果实整个生长发育过程中呈下调一上调的表达趋势，其中在成熟果中表达量最高。关键词：檫；肉桂酸～4一羟化酶；启动子；实时荧光定量PCR中图分类号：Q943．2文献

4、标识码：A文章编号：1001～一0009(2014)18-0122—06苯丙烷代谢途径是从莽草酸途径衍生的植物特有GIH是细胞色素P450(CYP450)单加氧酶超家族的次生代谢途径，是植物最重要的次生代谢途径之一。苯一员，它是第一个被鉴定的植物CYI450单加氧酶，也是丙烷代谢途径包括木质素合成途径、黄酮类物质合成途第一个既被克隆、又确定了功能的植物CYP450酶l1。]。径和原花青素特异合成途径，可以产生多种具有重要生植物受到辐射、机械损伤、诱导子诱导和真菌感染等刺理功能的多酚类次生物质。苯丙氨酸解氨酶(PAL)和激时，H活性及基因表达发生变化，使其在苯丙烷代肉桂酸一4一羟化

5、酶(H)分别催化苯丙烷代谢途径中的谢途径中扮演着不同的角色一。目前，多种植物编码合第1步和第2步反应。H的底物和产物包括反式肉成肉桂酸一4一羟化酶的基因已被克隆，如拟南芥J、大桂酸和p．香豆酸都受到苯丙烷代谢途径中PAl和其它豆、杨树、油菜、杏、李㈨、柑橘等。酶的调控。PAI和H这2种酶通常以}办同方式表该研究从已构建好的含不同发育时期的榇果实均达，但是协同机理还不确定，一化cDNA文库中筛选得到一个(H全长基因，对该基因进行生物信息学分析及启动子克隆，了解檫果实第一作者简介：王玉珍(1988-)，女，硕士研究生，研究方向为果树H基因的结构与功能，这对从分子水平上探讨檫苯丙生物技

6、术。E-mail：wyzhenabcde@163．COiTI．烷类次生代谢途径具有重要意义；采用荧光定量PCR技责任作者：陈桂信(1967一)，男，博士，副教授，研究方向为分子生物术，分析PsC4H基因在檫果实不同发育时期的表达模学与生物技术。E-mail：gui~nchen@126．COFI1．式，以期为进一步研究该基闪的表达调控机理、改变表收稿日期：2014-04-25达活性奠定工作基础。Abstract：TheorthogonaldesignwasusedtOoptimizeISSR-PCRamplificationsystemOnAnoectochilu,sro,rbur

7、ghiiinfourlevelsoffivefactors(DNAteInplate，gDNApolymerase，primer，咐，anddNTP)respectively，TheresultsshowedthatasuitableISSR-PCRreactionsystemwasestablished．namely25tzIreactionsystemcontai~ring40ngDNAtemplate，1．6OUT．aqDNApolymerase，0．80rmnol／I[)rimer，0．96nmlol／IdNTt，2．40mmol／IM．Inconclusion，this

8、establishedISSR—PCRreactionsystemprovideanavailableandreliablemethodforgeneticdiversityanalysisandgermplasmclssificatinofAnoectochilusrOrburghii．Keywortk：Anoectochilusroxburghii；ISSR-PCR；orthogonaldesign122北方园艺2014(18)：122～127·生物技术·1材料与方法倍，取1