砀山酥梨肉桂酸4-羟化酶基因克隆及表达分析

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4、究（项目编号：30771483）安徽省生物学重点学科建设项摘要苯丙烷途径是植物特有的次生代谢途径，也是植物三大次生代谢途径之一。在维管植物中，苯丙烷途径的终产物主要用于合成木质部的木质素单体和黄酮类物质。肉桂酸4-羟化酶(Cinnamate4-hydroxylase,EC1.14.13.11)属于细胞色素单加氧酶超家族中的CYP73A亚家族。C4H是公共苯丙烷途径的第2个关键酶，在整个途径中起着十分重要的作用。它催化反式肉桂酸的羟化反应形成4-羟基肉桂酸。为研究砀山酥梨木质素代谢过程中C4H的作用，本研究克隆砀山酥梨C4H的cDNA全长，并进行生物信息学、原核表达和实时荧光定量表达

5、分析；通过构建其真核表达载体，进行C4H蛋白定位和遗传转化研究。以期为利用分子生物学技术调控梨木质素的合成和石细胞的发育奠定了基础。主要研究结果如下：（1）克隆砀山酥梨肉桂酸4-羟基化酶基因的全长cDNA序列，命名为PbC4H，GenBank登录号为KF663548。PbC4H全长1764bp，具有1515bp的开放阅读框(ORF)，编码504个氨基酸。（2）生物信息学分析表明，PbC4H相对分子量为57.8kD，等电点(pI)为9.05。PbC4H与多个物种C4H编码的氨基酸序列具有较高的同源性，说明其在进化过程中较为保守。结构域分析表明，PbC4H具有跨膜结构域和典型的细胞色素

6、P450结构域特征。（3）实时荧光定量PCR检测表明，在自然授粉酥梨果实发育过程中，PbC4H的相对表达量高峰期在31d和55d，出现在石细胞、木质素含量高峰期之前。不同品种授粉导致PbC4H的相对表达量发生改变，其中砀山酥梨(♀)×圆黄(♂)果实中PbC4H表达量高峰期在花后31d和47d，砀山酥梨(♀)×鸭梨(♂)果实中PbC4H表达量高峰期在花后31d和79d。（4）构建了PbC4H原核表达载体pET-32a-PbC4H，在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达了PbC4H融合蛋白。（5）构建了植物表达载体pCAMBIA1304-PbC4H和反义RNA表达载体pBI121-antiP

7、bC4H。瞬时表达pCAMBIA1304-PbC4H，发现PbC4H蛋白定位于细胞膜上。通过农杆菌介导的浸花法，转化pCAMBIA1304-PbC4H重组质粒到拟南芥c4h基因突变体中，转化pBI121-antiPbC4H重组质粒到野生型拟南芥(Col-0)中，并筛选得到转基因植株。关键词：砀山酥梨，石细胞，木质素，C4H，表达分析，遗传转化IAbstractThephenylpropanoidpathway,oneofthreesecondarymetabolism