砀山酥梨阿魏酸5-羟基化酶基因的克隆与表达分析

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1、分类号：单位代码：10364密级：学号：12720428安徽农业大学学位论文砀山酥梨阿魏酸5-羟基化酶基因的克隆与表达分析CloningandExpressionAnalysisofFerulate5-hydroxylasegenefromPyrusbretschneidericv.DangshanSu研究生：徐超指导教师：蔡永萍教授申请学位门类级别：理学硕士专业名称：细胞生物学研究方向：分子生物学所在学院：生命科学学院答辩委员会主席：年月独创性声明本人义巧找个人化甘师巧甘Ｋ进巧的研光工作妓取站的硏化成声叫所Ｍ交的论■人己统化

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4、.DangshanSu）属白梨（PyrusbretshneiderRehd）系品种，是我国种植面积最广，产量最大的梨品种，经济价值突出。近几年来，由于气候变化、栽培管理粗放等原因，导致梨果实中石细胞含量增加、石细胞团增大，影响其食用品质和经济价值。石细胞是一种厚壁组织细胞，石细胞发育与木质素的合成、转运及沉积均密切相关。阿魏酸5-羟化酶(Ferulate5-hydroxylase，F5H)是木质素合成的关键酶之一，主要调控S-木质素的合成，在苯丙烷代谢途径中催化阿魏酸、松柏醛、松柏醇生成5-羟基阿魏酸、5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇。本研

5、究以砀山酥梨果实为材料，克隆PbF5H基因的全长cDNA，并对其进行生物信息学分析。通过在不同授粉品种砀山酥梨果实发育不同时期，研究PbF5H基因表达水平与石细胞发育的关系，并进一步对PbF5H基因的原核表达、亚细胞定位以及拟南芥的真核表达进行研究，为利用基因工程手段改造砀山酥梨的木质素含量提供了理论基础。主要结果如下：（1）克隆得到砀山酥梨阿魏酸5-羟基化酶基因PbF5H（Genbank登录号：KC852907）。其cDNA全长为1978bp，包含一个1551bp的开放阅读框，编码516个氨基酸，具有典型的P450家族保守结构域。推断P

6、bF5H蛋白的相对分子量约为58.4KD，等电点（PI）为6.49。分子式为C2614H4128N704O747S25。（2）砀山酥梨PbF5H与其他物种F5H氨基酸序列具有很高的同源性，尤其与碧桃F5H同源性最高，达到90%。系统进化树分析与染色体定位分析表明，PbF5H基因可能是砀山酥梨中参与木质素生物合成的阿魏酸5-羟基化酶。（3）砀山酥梨果实石细胞发育的阶段性：15-39d是石细胞发育初期，石细胞木质化程度较低，PbF5H出现第一个表达高峰，木质素主要由S单体组成；39-79d是石细胞发育高峰期，砀山酥梨果实的石细胞含量和木质素含

7、量都显著增加，且两者显著正相关，PbF5H出现第二个表达高峰；79-145d是石细胞发育末期，这一时期石细胞发育基本停止，PbF5H表达量趋于稳定，木质素主要由G-木质素单体组成。（4）构建了原核表达载体pET-32a(+)-PbF5H，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达得到了80kDa的PbF5H重组蛋白。（5）构建了真核表达载体pCambia1304-PbF5H-GFP。亚细胞定位表明PbF5H定位于烟草表皮细胞的细胞质膜上；进一步转化拟南芥fah1突变体，已初步筛选得到2株抗性拟南芥转基因植株。关键词：砀山酥梨，PbF5H，石细胞，

8、木质素，荧光定量表达，亚细胞定位IAbstractPyrusbretschneidericv.DangshanSu,isoriginatedinDangshaninAnhuiProvince,