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1、第43卷第1期海洋与湖沼Vol.43,No.12012年1月OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICAJan.,2012青蛤(Cyclinasinensis)金属硫蛋白及硫氧还蛋白*基因的克隆与表达分析①吕达罗凯娅潘宝平高虹(天津师范大学生命科学学院细胞遗传与分子调控天津市重点实验室天津300387)提要利用构建的cDNA文库及高通量测序方法,获得金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因全长。结果表明,青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白的cDNA全长分别为776bp和804bp,金属硫蛋白基因编码74个氨基酸,包含7个CXC特征结构;硫氧还蛋白基因编码165氨基酸,包含5个氨基酸构成的活性
2、2+中心。采用实时定量PCR方法分析了两种基因在Cd胁迫下的表达变化,结果显示,金属硫蛋白基2+因在Cd胁迫下6—12hmRNA表达量急剧上升,与对照组有显著性差异(P<0.01)。硫氧还蛋白基因2+2+在Cd胁迫下mRNA在6h明显升高,在6—24h与对照组出现显著性差异(P<0.05)。说明Cd能够诱导青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白基因表达的时序性升高,二者的转录过程反映了贝类抵御重金属胁迫的分子调控过程。关键词青蛤,金属硫蛋白(MTs),硫氧还蛋白(Trx),基因表达中图分类号Q789青蛤(Cyclinasinensis)是我国重要的海产经济贝抗重金属对细胞的损伤并延缓细胞的凋亡。
3、目前,国类,鉴于其生活在海滨河口区域并靠滤水进行呼吸内外有关硫氧还蛋白的研究报道主要集中在植物及及取食(王兴强等,2006;潘宝平等,2010),极易受到人类肿瘤研究方面,有关贝类硫氧还蛋白研究文献环境重金属的污染。金属硫蛋白(Metallothioneins,相对较少(Wangetal,2011),青蛤的Trx与MTs基因MTs)是一类广泛存在于生物体内,能够被金属离子及表达未见正式报道。及氧化损伤等因素诱导而产生的金属结合蛋白,参1材料与方法与生物体的重金属解毒和自由基清除等修复作用(刘维青等,2006)。MTs的表达水平反映了生物体对环境1.1实验材料的应激反应情况及对重金属的
4、解毒能力,通常用于青蛤样品采自天津大港海滨滩涂,选择贝壳指评价重金属的污染状况和生物体的适应能力(张桂春,标没有显著差异的成体,在人工海水中暂养7d,持续2005)。近年来,国内外有关MTs在无脊椎动物中已曝气,每天投喂5‰的小球藻(Chlorellasp.),选择闭有许多研究报道(Lemoineetal,2003;Rebeloetal,壳反应灵敏个体进行实验。2003)。硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)亦存在于众多原1.2实验方法核及真核生物中,是参与细胞内多种代谢过程的一1.2.1青蛤cDNA文库的构建解剖青蛤取不同类蛋白质(董文甫等,2006),它具有抗氧化和抑制调
5、组织置于1mlTRIZOL中提取组织总RNA,采用节作用(Spectoretal,1988)。一般认为,在重金属胁迫QIAGEN公司的OligotexmRNAKits方法进行分离纯条件下,Trx通过与细胞信号调节激酶的作用,来抵化。cDNA文库的构建根据Clontech公司的SMART*天津市科委应用基础与前沿技术重点项目资助,09JCZDJC19300号;天津市科委应用基础研究面上项目资助,10JCYBJC09100号。吕达,E-mail:zeustorm@163.com①通讯作者:潘宝平,博士,教授,E-mail:panbaoping@yahoo.com.cn收稿日期:2011-
6、05-23,收修改稿日期:2011-10-1048海洋与湖沼43卷cDNALibraryConstructionKit试剂盒说明书,连接载及硫氧还蛋白有很高的相似性。金属硫蛋白类似序列体采用pBluescriptIISK*改造体,感受态细胞为E.与三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)相似性最高(相似性coli(DH5a)。文库随机测序引物T7-F:5′TAATA-为44%,E值为2E-13),硫氧还蛋白类似序列与胸斑CGACTCACTATAGG3′,T3-R:5′AATTAACCCTCAC-草雀(Taeniopygiaguttata)相似性最高(相似性为52%,TAAAGG
7、3′,将所得序列去除载体序列后拼接得到E值为1e-41)。青蛤金属硫蛋白基因及硫氧还蛋白基contig及无法与其它序列拼接的singlest数据。因在GenBank的注册号分别为HM246244和1.2.2生物信息学分析将获得的青蛤MTs基因JN969050。及Trx基因类似序列在线进行BLASTX分析,使用青蛤金属硫蛋白基因的cDNA序列全长776bp,ORFFinder查找开放阅读框,SignalP3.0查找信号肽,5′UTR为113bp,3′UTR为
