基因的克隆与表达

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1、分子生物学综合性实验大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因克隆表达纯化吴海珍等华东理工大学应用生物学系二○○五年一月第一部分碱性磷酸单酯酶基因的定位、克隆与表达实验流程图碱性磷酸单脂酶基因在染色体DNA上的杂交定位――SouthernBlotting碱性磷酸单脂酶基因的体外扩增――PCR扩增PCR体外扩增片段的克隆连接于T-载体――连接连接产物转化大肠杆菌受体菌――转化转化子质粒DNA的抽提――快速法制备质粒转化子的鉴定――限制性内切酶酶切目的转化子DNA的大量制备――碱法抽提质粒DNA酶切回收克隆的目的基因片段――回收目的基

2、因重组表达型质粒的构建――连接、转化、鉴定重组大肠杆菌目的蛋白的表达――蛋白电泳实验路线E.coliChromosomalDNAE.coliChromosomalDNA杂交定位phoAPCR扩增AATT1.5kbpMD18-T连接转化转化子划线扩增快抽质粒酶切鉴定HindIIIHindIIISphISphINdeIPstINdeIPstIAccIAccIlacZSalIlacZSalIEcoRISphIAprNdeI0rBamHI1550ApSphI1415pMD-phoAphoA(1)0.4+3.7kb1.4+2

3、.7kbEcoRI1197phoA4.1kbpMD-phoAEcoRI1197XbaI(2)1.2+2.9kb0.2+3.9kb4.1kbrepSphI1415XbaIBamHIrepBamHIBamHI1550KpnINdeI0KpnISacISacIEcoRIEcoRI(1)(2)BamHINdeI/BamHIHindIIINdeIXbaI电泳回收T7SphINdeIBamHI1.5kbrApPstIpET-11a5.6kblacIori连接、转化、扩增和鉴定pET-11a:phoA7.1kb重组菌发酵、表达产

4、物纯化与测活目的蛋白1DNA的酶切摘要本单元主要介绍限制性核酸内切酶的各种特性、酶的保存方法和使用注意点，多种酶联合酶切的常用策略等。1.1实验原理DNA重组技术中的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或质粒DNA）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相对应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。限制性核酸内切酶几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特定位置上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。早在20世

5、纪50年代初微生物体内的限制核修饰作用就已发现，10年后细菌的限制和修饰作用的分子机制被阐明。以大肠杆菌为例，在K株和B株中都含有各自不同的限制――修饰系统，两种不同来源的－噬菌体（λK和λB）长期寄生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性的保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，故它们在感染相应的宿主细胞（K株和B株）时DNA不被降解，因此感染频率很高。当它们分别感染其他宿主细胞时，由于没有特异性的保护作用，入侵的DNA分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而

6、感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。这一现象普遍存在与原核细菌中。但由于宿主细胞内的降解作用的不完全，入侵的DNA分子总有极少数能完整保留下来并得以在细胞体内复制，而且在复制过程中被宿主细胞的甲基化酶所修饰。这修饰过的DNA分子再重新制备后导入该宿主细胞时，感染频率又能恢复到原来的高位，即限制――修饰作用被解除。1.1.1限制性核酸内切酶的分类目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类（见表1-1）。其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于

7、这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA的重组实验。I类和III类酶严格地说应该称为限制――修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位，包含在同一酶分子中。表1-1各类限制性内切酶的特性I类酶II类酶III类酶酶分子三亚基双功能酶内切酶和甲基化酶分开二亚基双功能酶4～6bp短序列，识别位点二分非对称序列5～7bp非对称序列大多数为回文结构距离识别位点至少在识别位点中在识别位点下游24～26bp切割位点1000bp，无特异性或靠近识别位点处限制性反应与甲基化反互斥分开的反应同时竞争应

8、2+2+ATP、Mg、ATP、Mg、S-腺苷2+限制作用所需的辅因子MgS-腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸（非必需）DNA重组中的用途无有无1.1.2II类限制性核酸内切酶的基本特性II类限制性核酸内切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有