小麦wox基因的克隆与表达分析

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万方数据硕士学位论文小麦WOX基因的克隆与表达分析CharacterizationandexpressionanalysisofWOXhomeodomaintranscriptionfactorinvolvedin。develooment。。wheatemDryoaeveloomentIrom研究生：赵珊指导老师：魏育明研究员江千涛研究员 万方数据CharacterizationandexpressionanalysisofWOXhomeodomaintranscriptionfactor·volved。!mbryodevelopmentfromwheatinvolvedinembry0developmentIromByShanZhaoDirectedbyProfessorYu—mingWeiProfessorQian—taoJiangJune，2014嬲㈣加㈣川 万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：怒无情沙炒年易月I1日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意INJII农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名趣竹J伽肛年舌月『JH仂一年6其|fB 万方数据小麦WOX基因的克隆与表达分析研究生：赵珊指导教师：魏育明研究员江千涛研究员摘要本研究以小麦及其近缘属作为研究材料，通过同源克隆，热不对称交错PCR及RT-PCR等方法，成功分离得到WOX2和WOX5s基因序列，并对TaWOX2和TaWOX5s基因的表达及功能进行了研究，了解它们在小麦胚胎发生过程中的作用。本研究主要结果如下：1．克隆得至UTd,麦WOX2基因序列，全长为2045bp，编码区长度为969bp，编码322个氨基酸残基。在氨基酸水平上进行序列比对发现，小麦WOX2与OsWOX2和ZmWOX2A的homeodomain区域相似性达89．6％和85．1％，并且该基因序列具有WOX家族现代进化支的2个保守结构域，homeodomain和WUS．box。据此认为，克隆到的序列编码小麦WOX2蛋白，命名为TaWOX2。2．克隆得到了小麦WOX5基因序列，序列分析的结果表明WOX5基因分为三种等位变异类型，全长分别为1038bp、1029bp和1032bp，编码区长度分别为639bp、630bp和633bp，编码209-212个氨基酸残基。将克隆得到的序列与水稻和玉米WOX5蛋白序列进行比对分析，发现TaWOX5a与OsWOX5和ZmWOX5B的相似性分别是78．8％和65．5％，并且TaWOX5s的homeodomain区域氨基酸序列与水稻玉米的该区域完全一致。TaWOX5s具有WOX家族现代进化支的3个保守结构域，分别是homeodomain、WUS．box和EAR．1ike。据此认为，克隆到的序列编码小麦WOX5蛋白，分别命名为TaWOX5a，TaWOX5b和TaWOX5c。在小麦近缘属材料中克隆到的WOX5基因高度同源，只存在两个位点的插入缺失变异。3．分别将TaWOX2和TaWOX5c分别连入原核表达载体pET-30a，转入大肠杆菌 万方数据BL21(DE3)中，经IPTG诱导基因成功表达，得到约34kDa和26kDa的重组蛋白。重组蛋白的分子量大小与核酸序列预测结果一致，表明克隆到的序列准确代表了该基因的开放阅读框。4．通过荧光定量PCR分析了这两个基因在普通小麦中的表达模式，TaWOX2主要在种子发育过程中表达，TaWOX2在种子发育过程中的表达水平很有可能反映了其在胚发育过程中的表达水平，因此，推测TaWOX2基因和小麦的胚发育相关。TaWOX5s主要在根和愈伤组织中表达，在愈伤组织中，TaWOX5s在2，4．D的诱导下表达量逐渐升高，而在NAA，6-BA，玉米素和激动素的诱导下表达量降低。因此，推测TaWOX5s可能与小麦根的形成和发育有关，并且TaWOX5的表达受生长素和细胞分裂素的调节。关键词：WOX,小麦，原核表达，荧光定量PCR，聚类分析II 万方数据CharacterizationandexpressionanalysisofWOXhomeodomaintranscriptionfactorinvolvedinembryo一●．●一‘一l●’developmentfromwheatShanZhaoDirectedby：Yu-mingWeiandQian—taoJiangAbstractInthisstudy,genessequencesencodingWOX2andWOX5proteinwereisolatedfromwheatanditsrelativesbyusingthestrategiesofhomologycloningtechniques，TAIL-PCRandRT-PCR．Then，wefocusedontheexpressionandfunctionalanalysisofTaWOX2andTaWOX5s．Inaddition，wetriedtoprovideevidencesforunderstandingtheireffectsinwheatembryogenesisthroughquantitativePCRanalysis．Themainresultsinthisstudyareasfollow：1．TheputativeWOX2genesequencefromwheatWaS2045bp，theopenreadingframe(ORF)WaS969bp，encoding322aminoacids．ThehomeodomainregionofWOX2proteinshared89．6％and85．1％sequencesimilaritywiththosefromriceandmaizeWOX2protein，respectively．DomainpredictionrevealedthatputativeWOX2proteinofwheathadtwoconservedfeaturesoftheWOXfamilyinthemodemclade，includingahighlyconservedhomeodomainandaWUS-box．2．Wecharacterized3allelesofWOX5fromwheat，namely,TaWOX5a，Ta7WOX5bandTaWOX5c，thesizeofallelesrangedfrom1029to1038bpandencompaSsedthecompleteORFaSwellaS5’upstreamand37downstreamsequences．ThesizeofORFsrangedfrom630bpto639bp，encoding209to212aminoacids．ThesequencesimilarityofTaWOX5awitllQrmandZmWOX5Bwere78．8％and65．5％，respectively．ThesequencesoftheTaWOX5shomeodomainwerethesameaSthoseofQHBandZmWOXB．DomainpredictionanalysisshowedthattheputativeprimarystructuresofTaWOX5scontainedallconserveddomainsoftheWOXproteinfamily,includingthehomeodomain，theWUS-box，andtheEAR-likedomain．TheWOX5genesfromwheatrelatedspeciessharedhighsequencesimilarity．3．Thefull—lengthORFofTaWOX2andTaWOX5cwereligatedintoaprokaryoticexpressionvectorpET-30a，andapproximate34一kDaand26-kDaproteinsweresuccessfullyexpressedinEscherichiacoliBL21(DE3)cells、ⅣithIPTGinduction，III 万方数据respectively．ThemolecularweightoftheexpressedproteinswasidenticaltothatpredictedbyDNAsequences，indicatingthattheclonedgeneswereaccuraterepresentationoftheWOX2andWOX5ORFs，respectively．4．TheresultsofquantitativePCRshowedthatTaWOX2wasprimarilyexpressedintheseedsandthetranscriptlevelincreasedintheprocessofseedsdevelopmentanddeclinedaftertheembryosmature，indicatingthatTaWOX2maybeinvolvedinwheatembryodevelopment．TaWOX5wasprimarilyexpressedintherootandcalli，andtheexpressionlevelwasinducedbyauxinandcytokinin．ItindicatedthatTaWOX5mayplayarolerelatedtorootformationordevelopmentandisassociated、析t11hormoneregulationinsomaticembryogenesis．Keywords：WOX；Wheat；Expression；Real-timequantitativePCR；PhylogeneticanalysisIV 万方数据目录1文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。11．1体细胞胚胎发育过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．2WOX基因家族研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．3WOX2基因在胚胎形成和发育中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．4WOX5基因在根端分生组织中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．5立题依据⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．62．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．1．1供试小麦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．1．2试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．1．3引物合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．82．2．1植物材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．2．1．1小麦愈伤组织诱导和分化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．2．1．2小麦组织及发育期种子收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．2．2基因组DNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．82．2．3RNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2．4mRNA反转录成eDNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2．5基因组DNA保守区域的PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．112．2．6PCR产物的回收、纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．112．2．7与TA克隆载体的连接反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．2．8大肠杆菌的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．2．8．1感受态细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．2．8．2热击转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．2．9阳性克隆筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．2．10序列测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．11电子克隆、热不对称交错PCR及RT．PCR获得ORF序列⋯⋯．13 万方数据2．2．11．1电子克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．2．11．2热不对称交错PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．2．11．3RT．PCR分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2．12序列生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．2．13原核诱导表达分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．2．13．1原核表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．2．13．2重组菌诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．13．3SDS．PAGE电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．14荧光定量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．182．2．14．1相对标准样品的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．14．2实时荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．14．3荧光定量PCR数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯193结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。203．1小麦WOX2基因的扩增和结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯203．2小麦黼基因扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．3WOX5基因在小麦族中扩增和结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．263．4构建系统发育树⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．4．1WOX2基因系统发育树的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．273．4．2WOX5基因系统发育树的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．283．5原核表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．6荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯324讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．344．1TaWOX2和TaWOX5s是小麦WOX家族的成员⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．344．2WOX2和WOX5在小麦基因组中的以多拷贝形式存在⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯344．3TaWOX2和TaWOX5s蛋白的功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．35参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36鸳定谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．40在读期间发表论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41 万方数据1文献综述1．1体细胞胚胎发育过程体细胞胚胎发生是指在离体培养情况下的植物细胞、组织或器官产生类似胚的结构，对于没有发生融合的细胞，它们的各个阶段形成过程类似合子的胚胎发生，最终发育成一个新个体的过程【11。目前，可以运用体细胞胚胎发生技术诱导裸子和被子植物产生体细胞胚，并获得完整的再生植株。该技术已广泛应用于生物领域中，如植物优良无性系的快繁、人工种子生产、突变体选择及植物基因工程等方面[2-51。体细胞胚胎发生是植物细胞全能性的重要体现，其途径类似于合子胚发育，但与合子胚发育相比还具有数量多、速度快和结构完整的特点，并且其再生植株的最初来源是单个胚性细胞，因此植物胚胎发生过程为在植物中研究早期胚胎发育提供了很好的模型【6】。这一过程受到外部和内部条件的影响，激素、碳源、氮源、光质、渗透压及培养方式等是主要的外部条件；植物的基因型和生理特性是主要的内部条件‘71。植物激素【8,91是最重要的调节因素之一，参与调节的激素主要有生长素和细胞分裂素，包括2，4．D，NAA，IAA，KT，6-BA。2，4．D是在体细胞胚的诱导过程中应用最普遍的生长素之一，小麦胚在添加了2，4．D的培养基中培养，其正常2，4．D双向运输机制被打乱，破坏了内源生长素的极性分布，从而抑制小麦的胚性发育【101。在各种内部和外部因素的相互作用下，引发了某些特异基因的表达，从而使体细胞的分化和发育发生改变，进行脱分化和愈伤组织再分化转变成为胚性细胞。目前，已从多种植物中发现了许多与体细胞胚胎发生相关的基因，如WUS，SERK，三即，BBM，LEC和LECl-LIKEEll‘1酬，已经从分子水平上开始认识植物的体细胞胚胎发生机制。1．2WOX基因家族研究概况植物干细胞和动物干细胞不同，它是存在于植物中的两“团”细胞，具有产生新的植物组织的潜能，分别位于茎的顶端分生组织(ShootApicalMeristem，SAM)和根的顶端分生组织(RootApicalMeristem，RAM)[17】。植物干细胞具备很强的自我更新能力，在细胞分裂和分化中起着关键的作用，通过在两个分生组织中发生作用而调节地上和地下部分的生长，最终形成新的植物器官。茎、叶和花就是从位于茎顶端分生组织中的干细胞发育形成的，地下部分的根则是由根顶端分生组织干细胞 万方数据的发育使得它不断地更新和生长。WOX(WUSCHEL．relatedhomeobox)是一类包含高度保守同源异型结构域的植物转录因子家族。通常，同源异型结构域(homeodomain)由60个高度保守的氨基酸组成，编码这些氨基酸的基因序列被称为同源异型盒(homeobox)。WOX家族基因作用于胚胎发育前后，对植物早期阶段胚胎的发生和后期器官的形成有着重要的作用【18】。聚类分析结果将WOX家族分为三个主要的分支：WOXl0、WOXl3和WOXl4组成古老进化支；WOX8、WOX9、WOXll和WOXl2组成中间进化支以及WUS／WOXl．7组成现代进化支。现代进化支的WOX转录因子还包含另外两个保守结构域，WUS．box和EAR．1ike[19，201。研究发现在拟南芥中有15个WOX家族基因，水稻中有12个该家族基因，玉米中有14个该家族基因【18，2¨。目前，WOX基因已在水稻、玉米、短柄草、杨树以及云杉等植物中被克隆和研究【21‘251。WUS(WUSCHEL)是WOX家族中最早被研究的一个基因，该基因在茎顶端分生组织中特异表达，对维持顶端分生组织和花序分生组织的结构和功能起重要的作用[14，26】；WUS在拟南芥中负责调控茎端分生组织干细胞的形成和维持，通过与CLV(CLAYATA)形成一个反馈调节环来调控茎顶端分生组织中器官的启动与分生细胞的维持【27'281。AtWOX2、AtWOX8和AtWOX9都在合子中表达，与植物胚早期的顶部和基部形成有关【291。AtWOX3主要在分生组织的外围细胞有表达，调控着营养时期和生殖时期干细胞的表达【30】，OsWOX3在水稻叶片发育中起作用，但在SAM中不表达[311。AtWOX4与拟南芥茎顶端发生组织和根顶端发生组织中的维管束的发育与形成相关【32】。AtWOX5与WUS具有非常相似的功能，主要控制拟南芥根顶端分生组织干细胞的活性【33,34】。AtWOX6与冷胁迫相关【351。AtWOXl3和AtWOXl4主要在根与花药部位有表达信号的积累，而且可能受到严谨地调控【36】。1．3WOX2基因在胚胎形成和发育中的作用在裸子植物中，Palovaara等㈣发现挪威云杉PaWOX2在胚胎发育早期大量表达，但在幼苗组织中表达量较低，在非胚性细胞中PaWOX2不表达，揭示了忍凇对早期胚胎发育有着重要作用，并且可以作为胚胎发生的标记基因。Park等【37】研究发现黑松PcWOX2基因集中在胚胎发生组织中大量表达，表明PcWOX2可作为黑松种子体细胞胚胎发生和胚胎发育标记基因。 万方数据AtWOX2基因是拟南芥茎顶端分生组织的胚顶端区域由球形胚发育而来的分子标记基因【18】。AtWOX2基因和AtWOX8基因共同在卵细胞中表达，受精后它们一起在合子中表达，在合子第一次不均等分裂后，AtWOX2基因在顶细胞中表达，而AtWOX8基因在基细胞中表达。在16细胞胚胎时期和早球型期阶段，AtWOX2基因的表达仍是集中在胚的顶部区域，之后表达信号消失。在心型胚时期，AtWOX2基因在下胚轴与根连接部位的表皮细胞环状处有微弱表达，而且在成熟胚、胚乳或胚后发育时期的花序中检测不至UAtWOX2基因的表达信号。Nardmann等【2l】研究发现，ZmWOX2A与AtWOX2基因在合子早期发育过程中的表达情况有着惊人的相似，它们分别标志着玉米和拟南芥顶细胞的命运，同时控制了茎端分生组织的形态建成。与AtWOX2基因不同的是ZmWOX2A基因起初在卵细胞中并没有表达，它只在合子中表达。从由几个细胞组成的原胚开始到茎端分生组织形成，ZmWOX2A基因一直在胚顶部区域特异表达，且始终保持着这种表达模式；当茎顶端分生组织开始分化以后，ZmWOX2A基因的表达信号则局限在胚的近轴一侧；最后，从原胚晚期到胚胎发育早期这一阶段，ZmWOX2A基因主要在胚近轴侧的L1层细胞中表达。这种表达模式上的相似性揭示了ZmWOX2A与AtWOX2基因是功能相似的一类基因，也预示着在被子植物进化过程中，WOX2基因可能决定着古老被子植物的胚胎细胞发育命运以及对茎顶端分生组织原基的形成起着重要的作用。霍盛楠等【38】通过半定量RT-PCR分析发现，OsWOX2基因在授粉后1～2天的种子中开始表达，从授粉后3天起，伪翮在发育中的种子中大量地积累，同时在叶片和幼嫩花序中也有微弱的表达。原位杂交分析发现OsWOX2基因在水稻胚胎形成和发育过程中起着重要作用。OsWOX2表达信号存在于晚期球型胚的所有细胞中，在授粉后5天左右，起始叶原基开始分化时，OsWOX2的表达主要集中于茎顶端分生组织、叶原基及胚芽鞘近轴面表层细胞，OsWOX2在盾片顶端也有较强的表达。在授粉后10天左右，基本上完成水稻胚胎发育，此时，OsWOX2的表达信号主要在茎顶端分生组织原体位置和叶原基、根顶端分生组织及根冠部位积累。1．4WOX5基因在根端分生组织中的作用在胚的形态建成完成之后，茎端分生组织和根端分生组织的干细胞池区域是植物体能够继续生长的细胞源泉。WUS基因在拟南芥茎顶端分生组织中心区域的表达为保持与它邻近不分化的干细胞群特性输入了正确的信号【14】。来自根顶端分生组织 万方数据静止中心的信号也起到了控制其周围干细胞不继续分化的作用139】，进一步研究发现，正是WOX5基因起到了类似茎顶端分生组织中WUS基因的作用【181。AtWOX5在拟南芥早期球型胚阶段的胚根原细胞特异表达，在胚根原细胞发生分裂后，AtWOX5的表达信号在后来会分化形成静止中心的一个透镜状的细胞中积累。在心型胚和子叶形成阶段，检测到AtWOX5在胚的静止中心处的4个细胞中有表达信号积累，而这4个细胞正是由前期的透镜状细胞发育而来的【401。此外，AtWOX5基因还在子叶维管组织原基相关细胞中有表达信号。AtWOX5的表达信号在晚期心型胚中达到最强，之后开始逐渐降低。近年来，WOX基因在玉米中有了比较深入的研究。Nardmann等【2l】研究发现，ZmWOX5在玉米基因组中存在ZmWOX5A和ZmWOX5B两个同源基因，且它们与玉米根的发育相关。ZmWOX5B基因被认为是与拟南芥WOX5的同源基因，主要在玉米根端静止中心表达。ZmWOX5B在根静止中心处的特异表达揭示了它是根分生组织原基的标志性基因。与AtWOX5和OsWOX5基因的表达【18，22】不同的是ZmWOX5B在玉米成熟胚的根及以后营养生长阶段的幼苗中，在根静止中心之外的原维管组织形成层细胞中也有表达。OsWOX5(QHB)是水稻助∞瑾因家族成员之一，与AtWOX5和Z砌砌伽一样，它在水稻根端分生组织干细胞的形成及维持过程中同样起到了关键的作用[221。OsWOX5基因在水稻根端静止中心细胞处特异表达，在胚胎发生阶段及不定根的形成过程中，OsWOX5基因表现出一种早于根形态学分化的表达模式。霍胜楠等【38】通过半定量RT-PCR分析发现，检测到仇阳黔基因主要在幼苗茎端分生组织和发育接近成熟的胚中表达，而在根尖、幼穗及授粉前胚囊中的表达量较低。1．5立题依据小麦是我国第二大粮食作物，常年种植面积在2500万公顷左右，中国有50％以上人口以小麦为主粮。普通小麦(AABBDD，2n=42)是异源六倍体作物，由A、B和D三个基因组构成，它们分别来源于不同的小麦野生二倍体近缘属。A基因组来源于乌拉尔图小麦，B基因组来源于拟斯卑尔脱山羊草，D基因组来源于粗山羊草。在小麦的进化过程中，首先A基因组供体材料乌拉尔图小麦和B基因组供体材料拟斯卑尔脱山羊草(或一种未知的但与B基因组高度同源的物种)天然杂交，形成四4 万方数据倍体小麦(AABB)，然后四倍体小麦再与D基因组的供体材料节节麦杂交，形成六倍体小麦(AABBDD)[41,42】，再通过长期的进化，形成基因结构和功能多样性的普通小麦。近年来，尽管人们以拟南芥、水稻和玉米为突破点，通过对大量突变体及转录因子的研究与探索，对植物的胚胎发生过程有了比较详尽的认识，但在小麦中的研究还甚少，对小麦胚胎发育机制的了解还很有刚14】。普通小麦组织培养最早始于1968年，次年获得再生植株[43，441。小麦体细胞胚胎发生过程适合作为外源基因的受体，在小麦基因工程技术上发挥重要作用。通过胚胎发生相关基因的鉴定和研究，有助于明确植物离体培养有关性状的调控网络和遗传控制。本实验拟利用同源克隆、热不对称交错PCR和RT-PCR想结合的方法，克隆到普通小麦的WOX基因家族成员TaWOX2和TaWOXSs基因，并对其进行序列和分子特征分析以及表达模式分析，从分子水平上深入了解该基因，预测分析该基因功能，为揭示小麦胚胎发育机制提供理论依据，也有助于提高小麦组织培养的再生率和遗传转化率。同时，对节节麦，一粒小麦，乌拉尔图小麦，拟斯卑尔脱山羊草，西尔西斯山羊草，沙融山羊草，高大山羊草，双角山羊草，四倍体小麦以及六倍体普通小麦WOX基因进行研究，分析普通小麦及其近缘属物种同源WOX基因序列的差异，对明确WOX基因的进化具有重要意义。 万方数据2材料和方法2．1材料2．1．1供试小麦普通六倍体小麦(TriticumaestivumL．，基因组AABBDD)中国春和品种材料良麦4号以及6份节节麦(Aegilopstauschii，基因组DD)为本课题组保存。4份一粒小麦(Zmonococcumsubsp．口唧lopoides，基因组AmAm)和2份乌拉尔图小麦(Triticumurartu，基因组AuAn)，11份拟斯卑尔脱山羊草(Ae．speltoides，基因组SS)3份西尔西斯山羊草(Ae．searsii，基因组S洲S)，4份沙融山羊草(Ae．sharonensis，基因组S8hS8h)，1份高大山羊草(Ae．10ngissima，基因组SISl)，2份双角山羊草(Ae．bicornis，基因组sbsb)和7份四倍体小麦(Zturgidum，基因组AABB)由美国作物种质资源库(http：／／www．ars．grin．gov)提供，具体情况见(表1)。表1普通小麦及其近缘属资源材料详情表 万方数据续前表2．1．2试剂pMD-19T载体、Taq酶、dNTP、PrimeScriptRTreagentsKitwithgDNAEraser(cDNA第一链合成试剂盒)和SYBRPremixExTaqIIKit(荧光定量试剂盒)等试7 万方数据剂购自大连宝生物工程有限公司(瑚<撒)，TRNzol总RNA提取试剂购买白天根生化科技有限公司(TIANGEN)，质粒小量提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自美国OMEGA公司。2．1．3引物合成基因克隆和荧光定量PCR引物由上海英骏有限公司合成。2．2试验方法2．2．1植物材料2．2．1．1小麦愈伤组织诱导和分化1。田间取开花后12．15d的普通小麦种子，先用70％乙醇消毒1．2min，再用15％的次氯酸钠消毒15min，最后用无菌蒸馏水洗3．4次，备用。2．用手术刀挑出幼胚，盾片朝上接种于愈伤组织诱导培养基(MS基本培养基+309／L蔗糖+0．59／L脯氨酸+O．59／L谷氨酰胺+0．159／L天门冬氨酸+O．39／L酪蛋白水解物+O．1g／L肌醇+2mg／L2,4．D+2．49／L植物凝胶，pH=5．8)上，26。C黑暗培养。分别取诱导3d、6d、9d和12d的愈伤组织，其中12d的愈伤组织分为胚性愈伤(EC)和非胚性愈伤(NEC)，样品保存于．70。C。3．小麦幼胚在暗培养12d后，将愈伤组织转移至分化培养基(MS基本培养基+309／L蔗糖+lmg／LNAA+lmg／L6，BA+2．49／L植物凝胶，pH=5．8)上，25。C光照培养。分别取分化5d、10d、15d和20d的再生组织，在．70。C保存用于RNA提取。2．2．1．2tJx麦组织及发育期种子收集分别取小麦根、茎、叶、小穗、雄花和雌花，从小麦开花后3天开始收集种子，每隔3天取一次，直到种子成熟。所有样品用液氮冷存，在．70。C保存用于RNA提取。2．2．2基因组DNA提取采用Aldrich和Cullis(1993)[45】改进的CTAB法提取。1．取新鲜叶片0．1．O．49，迅速在液氮冷冻下磨成粉末。将粉末放入2ml离心管中，然后加6001．d缓冲液(100mMTris．HClpH=8．0，20mMEDTApH=8．0，2％CTAB，1．4MNaCI，2％PVP，用前加O．2％B．疏基乙醇)，充分混匀。2．置于65。C水浴40．60min，其间温和地混匀几次。3．取出后室温放置10min，加入600ul的24：1的氯仿／异戊醇，颠倒混匀后静 万方数据置10min，10000r／min离心lOmin。4．吸取500Itl上清液于另一离心管中，加入5009l冰冷的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀，．20℃静置1h。5．勾出DNA沉淀，用80％乙醇冲洗2．3次后再用100％乙醇洗1次，置于超净工作台吹干。6。加入100．200I_tl的1xTE溶解DNA备用。2．2．3RNA提取使用天根公司的TRNzol总RNA提取试剂来提取RNA，具体步骤如下：1．取新鲜组织，在液氮中迅速研磨成粉末后装入离心管中，加入lmlTRNzol，混匀。2．将混匀的匀浆样品在室温放置5min。3．离心机冷冻至4"C，将匀浆样品以12000r／min离心10min，吸取8001．d上清液到新的离心管中。4．加入200p．1氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温静置5min。5．离心机温度40C，12000r／min离心10min，吸取600txl上层水相到新的离心管中。6．加入6001xl异丙醇，混匀，室温放置20min。7．离心机温度4"C，12000r／min离心10min，去上清。8．加入lml75％酒精(DEPC处理过的水配制)清洗沉淀。9．离心机温度4"C，5000r／min离心3min。倒出液体，室温在超净工作台放置晾干。10．加入30—50I．tlRNase-freeddH20，混匀，让RNA充分溶解。置于．70"C超低温冰箱保存。11．取2肛l用1％的普通琼脂糖凝胶电泳检测。2．2．4mRNA反转录成cDNA反转录使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentsKitwithgDNAEraser，反转录步骤：1．基因组DNA的除去反应：9 万方数据5xgDNAErasserBuffer2p,1gDNAErasser1“1TotalRNA0．5-lp．gRNasefleeddH20upto10山2．在PCR仪上进行下列条件反应：42℃2min4℃forever3．在上述离心管中配制下列反转录反应液：5×PrimeScriptBuffer24rtlPrimeScriptRTEnzymeMixI1“1RTPrimerMix11．d上述去gDNA后反应液lOI．tlRNasefreeddH2041xl‘rotal20p,l4．在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：37℃15min85℃5s4℃forever2．2．5基因组DNA保守区域的PCR扩增在NCBI搜索已上传不同物种的朋搭基因，通过DNAMAN软件比对，在根据保守区域序列设计兼并引物，如下：HDF：5’—-TGGACVCCGACGVCGGAGCAGRT_一3’HDR：5’—GCCTTGTGGTTCTGGAACCAGTAGAA一3’PCR反应组成：模板DNA50rigdNTPs200肛M10xTaqplusPCR缓冲液2．5“l弓I物F(50斗M)0．5pl弓f物R(50肛M)0．5¨lTaqplus酶0．625UddH20加至终体积25I．tllO 万方数据PCR反应程序：94℃5min94℃45s_、60。C30sr30个循环一72℃30s72℃10minPCR产物在3％琼脂糖凝胶上分离，140V恒定电压电泳45min。2．2．6PCR产物的回收、纯化按照OMEGA公司的胶回收试剂盒的使用说明书，步骤如下：1．将含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶块放入干净的离心管中，称取重量。2．按照lg／rrd的比例向胶块中加入溶胶液BindingBuffer(XP2)。在55"C·654C温度下，水浴10min左右，期间不时上下颠倒翻转离心管直到胶块充分溶解。3．取700I．tl上一步所得混合溶液加入一个吸附柱中，吸附柱放入2ml的收集管中，10000r／rain离心lmin，倒掉废液。如果混合溶液体积大于7009l可重复此步骤。4．加入3009lBindingBuffer(XP2)溶液到吸附柱中，10000r／min离心lmin，倒掉废液。5．加入7001xlSPWWashbuffer，10000r／min离心lmin，倒掉废液。重复此步骤一次。6．12000r／min离心2min，尽量除尽残存的液体。将吸附柱置在室温下放置数分钟。7．将吸附柱放到一个新的1．5ml的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30．50山ElutionBuffer或灭菌水，室温放置2min。12000r／min离心lmin洗脱下来的溶液既为DNA回收产物。8．取2出用琼脂糖凝胶电泳检测，置于．20"C保存。2．2．7与TA克隆载体的连接反应按照TaKaRa公司pMDl9．T试剂盒的使用说明书，反应体系如下：DNASolutionIpMDl9-TVector4．5“l5rtl0．59lTotaluptolO山将该混合体系放入16℃连接过夜。 万方数据2．2．8大肠杆菌的转化2．2．8．1感受态细胞的制备1．用灭过菌的接种环挑取一点冻存的大肠杆菌JMl09菌干粉，加入10mlLB液体培养基中，37℃200r／min震荡培养过夜。2．用接种环蘸取培养后的菌液，在一个LB琼脂平板表面划线，置于37℃培养箱活化培养12h。3．再从活化的长势良好的大肠杆菌单斑中挑取一个，转入到2mlLB液体培养基中，37"C200r／min震荡培养过夜。4．取lml活化的菌液加入到含50mlLB液体培养基的500ml容积的锥形瓶中，37℃200r／min震荡培养大约4h(OD600≈0．4)。5．将菌液转移到干净的50ml离心管中，冰浴30min。4"C4000r／min离心10min，去掉上清液收集菌体。6．用20ml冰冷的O．1mol／LCaCl2溶液重新悬浮菌体，然后立即冰浴30min。7．4"C4000r／min离一tl,10min再次去掉上清液收集菌体。8．用2ml冰冷的0．1mol／LCaCl2悬浮菌体，分装为100I_tl／管，放在冰上备用。2．2．8．2热击转化1．取100I-tl感受态细胞，加入109l连接产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。2．42℃水浴锅中热激90s(期间不能摇动)，然后立即冰浴2min。3．向离心管中加入500I_tlLB液体培养基，混匀后在37℃恒温摇床中180r／min培养lh。4．将复苏培养后的菌液均匀涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基平板上。5．37"C恒温培养箱中倒置培养12．16h。2．2．9阳性克隆筛选挑取平板上生长良好的单菌落进行PCR扩增，扩增使用载体上的引物M13：M13F：5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG．3’M13R：5’．CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC．3’ 万方数据PCR反应组成：少量菌体-10xTaqPCR缓冲液2．51．ddNTPs2001xMM13F(50¨M)O．5lalM13R(501．tM)O．51．tlTaq酶0．625UddH20加至终体积251．dPCR反应程序同2．2．5。2．2．10序列测定随机选取阳性克隆送往上海英骏生物公司进行测序，序列比对、翻译和分析在DNAman6中进行。2．2．11电子克隆、热不对称交错PCR及RT-PCR获得ORF序列2．2．11．1电子克隆根据获得的助0Ⅸ基因片段在GenBank上找到相应片段在其它物种的全长基因，同源性比较表明它们高度同源，再以其它物种的全长序列为基础在(http：／／www．ncbi．nih．gov／blast／Blast．cgi)网站上对EST库进行BLASTN查询，结果找到了几条高度同源的小麦EST片段，利用DNASTAR或DNAMAN软件把这几条EST拼接在一起，得到了具有起始密码子和终止密码子的小麦拼接序列，再通过BLASTX验证该拼接片段是否符合预i贝[J[46,47】。2．2．11．2热不对称交错PCR为了得到WOX5基因的完整开放阅读框序列，根据PCR扩增和序列拼接结果设计3条引物P1、P2和P3进行热不对称交错PCR，随机引物是根据Liu(1995)[4s】设计，分别为APl、AP2和AP3，引物根据序列如下：P1：5’——GCTACTGCT久ACTTACATGTCATG一3’P2：5’—jACGGCCGGTCTCTTCATCGTT一3’P3：5’—-TTGTGGTTCTGGAACCAGTAGAAGACG一3’AP1：5'--NTCGA(G／C)T(A／T)T(G／C)G(A／T)GTT--3’AP2：5'--NGTCGA(G／C)(A／T)GANA(A／T)GAA--3’AP3：5'--(A／T)GTGNAG(Aff)ANCANAGA一3’整个PCR分3步进行，具体步骤如下：1．1stPCR反应13 万方数据14按以下组分配制PCR反应液GenomicDNAdNTPMixture(2．5mMeach)10xLAPCRBufferII(M92+plus)TaKaRaLATaq随机引物APl／AP2／AP3(100pM)特异引物P1(100pM)加ddH20至总体积反应条件：94薯30s65lmin72"C2h环min℃≯5个循环J94℃30s；25℃3min；72℃2min94℃30s；65℃lmin；72℃2min94℃30s；65℃lmin；72℃2min94℃30s；44℃lmin；72℃2min72℃10min2．2ndPCR反应按以下组分配制PCR反应液1stPCR反应产物dNTPMixture(2．5mMeach)10xLAPCRBufferII(M92+plus)TaKaRaLATaq随机引物APl／AP2／AP3(100pM)特异引物P2(100pM)加ddH20至总体积反应条件：94℃30s；65℃lmin；72℃2min94℃30s；65℃lmin；72℃2rain94℃30s；44℃lmin；72℃2rain72℃10min3．3rdPCR反应100rig8山5“l2．5U1“l1山501x1]l15个循环j1山8山59l2．5U1m1肛l50山15个循环 万方数据按以下组分配制PCR反应液2ndPCR反应产物dNTPMixture(2．5mMeach)10xLAPCRBufferII(M92+plus)TaKaRaLATaq随机引物APl／AP2／AP3(100pM)特异引物P3(100pM)加ddH20至总体积反应条件：94℃30s：65℃lmim72℃2min94℃30s：65℃lmim72℃2min94℃30s；44℃lmin；72℃2min72℃10min1肛l81xl5肛l2．5Ullxl1“150}t1]I15个循环／PCR产物检测、回收、克隆和测序方法同上。2．2．11．3RT-PCR分析[491根据序列拼接结果，在编码区的两端设计一对特异引物进行ImPCI滞增，详细引物序列为：WOX5一F：5’—GCGGGCGGGTGGGAGTGAA一3’WOX5一R：5’—TGCGTGCGTGCGACGTTGAT_-3’WOX2一F：5’—ACAGAGCAGATCCGTCCTCCTTAGCC一3’WOX2一R：5’—CTCCTTGAGTCGGTGTTCAGCTTAGTGA一3’PCR反应组成：反转录eDNA29ldNTPs200I．tM10xTaqplusPCR缓冲液2．59l引物F(509M)0．59l引物R(509M)0．59lTaqplus酶O．625UddH20加至终体积25山PCR反应程序：94℃60℃72℃橐3015 万方数据PCR产物在1．5％琼脂糖凝胶上分离，140V恒定电压电泳45rain。2．2．12序列生物信息学分析序列比对分析和氨基酸序列翻译在DNAman6中进行。系统发育树采用ClustalW和Mega4．O【50】进行构建。2．2．13原核诱导表达分析2．2．13．1原核表达载体的构建通过PCR方法在WOX2和WOX5eDNA片段两端分别添加NdeI和EcoRI酶切位点，PCR反应体系和程序同eDNA扩增，引物如下，下划线为添加的酶切位点：BdWOX5F1：5’—-TATQ堑笪造GAGGCGCTGAGCGGGCGGGTGGGAGTGAA一3’BdWOX5R1：5’—GTC鱼&迎TGCGTGCGTGCGACGTTGA-T_一3’BdWOX2F1：5’—．TAT￡△!△!鱼AGAGCAGATCCGTCCTCCTTAGCC—-3’BdWOX2R1：5’—-(订C鱼世笺Ⅱ旦CTTGAGTCGGTGTTCAGCTTA(汀GA-3’在琼脂糖凝胶电泳上检测后，将所需的目的片段胶块切下来进行DNA回收，再连入pMDl9．T载体上送公司测序验证片段是否正确，方法同上。提取测序验证正确的克隆质粒和原核表达空载体质粒，使用Omega公司质粒提取试剂盒，具体步骤如下：1．挑选长势良好的单菌落，接种到6ml含50rtedn[1l卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养箱200r／min振荡过夜；2．用培养好的菌液进行质粒提取，将菌液转移至一个15ml的离心管中，10000r／min离心lmin，倒掉培养基液体；3．用移液枪吸取残留的培养基；4．加入250I-tl加入RNA酶的SolutionI，均匀悬浮细菌沉淀，不留菌块；5．加入250}tlSolutionII，温和并充分地上下翻转使菌体充分裂解，直至形成透明的液体；6．加入350}tlSolutionIII，温和颠倒6．8次，出现白色絮状沉淀；7。12000r／min，离心10min，将离心后得到的上清液转移到一个离心柱里；8．10000r／min，离心lmin，并弃去收集管里的废液；9．向离心柱里加500I-tlBufferHB，10000r／min离心lmin，并弃去收集管里的废液；10．向离心柱内加7001al漂洗液SPW于10000r／min离心lmin，弃去收集管里的 万方数据废液，重复一次；11．12000r／min离心2min，尽量除尽漂洗液；12．将离心管放入一个新的1．5ml的离心管中，向离心柱滤膜上悬空加入30．509l洗脱液，室温静置2mira13．12000r／min离心lmin，离心后1．5ml管内含有质粒DNA溶液，存放于．20。C中备用；14．取所提质粒lgl在1％琼脂糖凝胶上电泳检测质粒的大小和质量。用限制性内切酶NdeI和EcoRI消化所提取质粒DNA，37。C水浴4h进行酶切反应，琼脂糖凝胶电泳后检测重组质粒是否正确，正确后分别回收目的片段和载体片段。酶切反应体系如下：10xMbuffer5肛l质粒10I．tlNdeI2肛1EcoRI2“1ddn20加至终体积50I．tl将目的片段插入原核表达载体pET30a的相同位点，连接反应体系如下：10x连接buffer1“1目的基因片段3斗1pET30a载体片段O．5“lT4连接酶lglddH20加至终体积10I．tl混匀后置于22。C连接6h，将10I_tl连接产物加入100I_tl大肠杆菌JMl09感受态细胞，然后进行热击转化，再涂布于含有50rtg／ml卡那霉素的LB平板上37。C培养过夜。挑取单个茵落划线扩大培养后用PCR和酶切鉴定，正确的克隆送公司进行测序。2．2．13．2重组菌诱导表达将测序正确的克隆分别命名，提取质粒后转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，选取阳性克隆进行重组蛋白表达，具体操作步骤如下：1．挑取长势良好的单菌落，接种到4ml含50I．tg／ml卡那霉素的LB液体培养基中，37。C恒温振荡培养过夜； 万方数据2．取过夜培养基的菌液以1：100的比例接种到lOml新鲜的含50ng／I．tl卡那霉素的LB液体培养基，置于37℃摇床(200r／min)振荡培养至OD值为O．5左右，加入终浓度为0．5mM的IPTG，置于30℃下进行缓慢振荡分别诱导2h，4h和6h。同时设空载体pET30a和未诱导重组菌作为对照；3．离心收集5ml诱导菌液，加入5009l蛋白提取液(1％SDS，0．25MTris．HCl，pH=6．8，5％2．巯基乙醇，2％溴酚兰，10％甘油)混匀进行裂解，煮沸10min，12000r／min离心10min后取上清液5“l，进行12％SDS．PAGE分析。2．2．13．3SDS．PAGE电泳先制备12％的分离胶，凝固后制备5％的浓缩胶，具体配方如表2，待浓缩胶凝固后把出梳子，放入缓冲液(O．3％Tris，1．44％甘氨酸，0．1％SDS)，上样静置2min后开始电泳。溴酚蓝指示剂在浓缩胶区域中设定恒压70V，在分离胶中设定恒压90V，当指示剂跑出分离胶后再跑15min即停止电泳。小心取出凝胶，在O．1％R250考马斯亮兰下染色1h，然后用无菌水脱色直到条带清晰。表2SDS．PAGE胶配方2．2．14荧光定量根据已得得小麦WOX2和WOX5基因的eDNA序列，应用primer5设计荧光定量PCR引物。设计原则如下：一般退火温度设为58．60℃，上下引物退火温度的差值小于1，引物长度为20．24bpj扩增片段的长度限定在100．200bp之间。选择actin基因为内参【511。引物序列如下：qWOX2F1：CCCCATCGAGGGCAAGAACGqWOX2R1：CGGCGGAACTGCTTGGAGAA 万方数据qWOX5F1：ACAGCAGCAGCAACGATqWOX5R1：CTCACATAGCATGTCATGATCCGGactinF：GTTCCAATCTATAAGGGATACACGCacting：GAACCTCCACTGAGAACAACArTACC2．2．14．1相对标准样品的制备PCR扩增获得目的片段，电泳检测后切胶；然后用天根DNA回收试剂盒回收DNA片段。将PCR产物与pMDl9．T载体连接，转化到JMl09感受态细胞，经过培养后筛选阳性克隆，用LB液体培养基进行培养。然后提取质粒用来制作相对标准品。2．2．14．2实时荧光定量PCR采用TaKaRa公司的实时荧光定量PCR试剂盒SYBR⑧PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)，在BioRadCFX96实时荧光定量PCR检测仪上运行，实时荧光定量PCR反应混合液包括：SYBR⑧PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)(2x)10I-tl，10弘M引物(上下游引物)各1“l，模板eDNAl}tl，加灭菌超纯水至20I_tl。扩增程序：95℃5min；95℃15s，60℃20s，72℃20s，读数5s，40个循环；72℃延伸10min；融解曲线范围为50．95℃，每0．2℃读一次数，时间为3s。将合成后的eDNA稀释100倍作为待测样品。同时将相对标准品按照10的倍数稀释6个梯度(1x106，lxl05，lxl04，lxl03，lxl02，lxl01)，作为建立标准曲线的模板，用于标准曲线的制备。另外以水作为阴性对照(仅无模板，灭菌双蒸水代替模板，作为空白对照)，来检测实验过程中的试剂污染。所有的样品均做三次重复，来确保实验室数据的可信度。2．2．14．3荧光定量PCR数据分析融解曲线分析：根据融解曲线的峰值情况来验证引物的特异性。标准曲线制作：以含有目的基因的质粒来制作标准品，将标准品稀释至有一定梯度的不同浓度，如lxl06，lxl05，lxl04，lxl03，lxl02，lxl01，以标准品拷贝数的对数值和CT值分别作为横坐标和纵坐标绘制标准曲线。实验结果分析：在荧光定量PCR反应的指数期设定合适的阈值，从而对未知浓度样品进行监测和比较。软件可以通过设定的阈值，自动生成每一样本(均设三次重复)Ct值的平均值。根据标准曲线和样品模板的Ct值可以计算出起始拷贝数，将Ct值代入标准曲线公式就可以得出样品的起始模板量。以actin基因作为内参校正模板浓度，数据分析采用标准曲线法【521计算。 万方数据3结果与分析3．1小麦WOX2基因的扩增和结构分析通过拟南芥、水稻和玉米的两啜基因序列比对，在保守区域设计兼并引物在小麦的基因组DNA中进行PCR扩增，产物在3％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，检测到一条160bp差E右的目的片段(图1)。将该目的片段切胶回收后连接至IJpMDl9一T载体上，然后转化到大肠杆菌感受态细胞中。通过PCR扩增确认为阳性克隆后进行测序。200bp100bpl234图1WOX5homeobox区域PCR扩增图M：TIANGENDNAMarkerI，1-4：中国春Fig．1PCRamplificationofWOX5homeoboxM：DNAMarkerI．1-4：ChineseSpring将从以上材料中克隆测序得到的其中一条DNA序列，在NCBI数据库中Blast得到一条小麦中国春eDNA文库中克隆序列(GenBank登录号：j峨35177)。该序列包含WOX基因家族保守的同源异型结构域homeodomain序列，与拟南芥、玉米和水稻WOX2基因homeobox区域进行比对，相似性分别为67．5％、88．7％和88．7％。通过该序列在编码区5’端和3’端设计引物对中国春基因组DNA进行扩增得到一条2000bp左右的条带(图2)。测序结果与序列(AK335177)一致，该序列全长2045bp，包含完整的ORF，有2个外显子，1个内含子，外显子长度分别为491bp和478bp，内含子长度为943bp，5’上游序列29bp和3’下游序列104bp。该序列中编码区长度为969bp，编码322个氨基酸残基。根据测序结果进行序列同源性比对分析，发现在氨基酸水平上与NCBI已公布的OsWOX2和ZmWOX2A的homeobox区域相似性达89．6％和85．1％(图4)，因此推测克隆的基因是小麦WOX2，并命名为TaWOX2。BlastP结果表明，克隆到的TaWOX2从 万方数据40至U105个氨基酸区域为WOX2保守的同源异型结构域homeodomain。并且该基因序列具有WOX家族现代进化支所特有I拘homeodomain和WUS-box[19】两个特异结构(图3，4)。200∞p—◆、rgDNA图2小麦僦PCI扩增图M：TIANGENDNAMarkerIII，gDNA：中国春基因组DNA扩增Fig．2IsolationofWOX2inwheatM：TIANGENDNAMarkefllI．gDNA：PCRamplificationofgDNAinChineseSpring将小麦WOX2与水稻WOX2、玉米WOX2、大豆WOX2、拟南芥WOX2、葡萄WOX2、牵牛花WOX2、银杏WOX2、西红柿WOX2、鹰嘴豆WOX2、草莓WOX2和黄瓜WOX2进行多序列比对分析，结果发现12种植物的WOX2在5’homeodomain区域高度保守，而在3’区域差异明显(图4)。homeodomatnWUSbox姗嗽[二二]■——●二二二二二二二二二二二1【二二]珑●■OsWOX23137,aWOX2324AIWOX2260图3WOX2蛋白的结构域示意图注：红色表示homeodomaim蓝色表示WUS．box；F远．3StructureofWOX2proteinsinwheat,rice，maize，andArabidopsis．Note：Thehomeodomain(red)isthemostprominentanddefiningfeatureofthefamily．TheWUS-boxmotif(blue)wasdefmedinastrictsense，asT-L·[DEQP]·L-F·P-[GITVL]·[GSKNTCV]，consensusTIEI，FPI21 万方数据TaWOX2OsWOX2ZmWOX2AAtWOX2VvWOX2GmWOX2CaWOX2PhWOX2S1WOX2FvWOX2CsWOX2GbWOX2OsWOX2ZmWOX2AAtwOX2VvWOX2GmWOX2CaWOX2PhWOX2SlHOX2FvWOX2CsWOX2GbWOX2OsWOX2Z：IIWOX2AAtWOX2VvWOX2GmWOX2CaWOX2PhWOX2SlWOX2FvWOX2CsWOX2GbWOX2OsWOX2Zrr【WOX2AAtWOX2VvWOX2GmWOX2CaWOX2PhWOX2SiWOX2FVWOX2CsWOX2GbWOX2MESVEHQQQglTRSRSP．．SLP^j％PPSPMETTT?TLGGGGGSRAGGFSDPPSPLSPMETPQQQSAA删％AAHG．．．QDCGGSP⋯．．⋯⋯．⋯⋯MESGNNTNHELEMEM．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．MDTTGKT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．．MDG⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．MSD⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯．⋯．MEG￡DQQV．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．MTAEVGDGMLQDSANIIQPSSAASSSSSSEEEDMSSTQRKD黛．．．MAyI．薰．．．．．蒸．LLHKTSR；垂YTS．．．垂；HVS●●●VC=HomeodomainRALQLPPAAGTH．GPPAARSRAAGRGAAEAEGH．GRRGGGAG．AGQQPGPLAG．H．P．．．．．．．FDRFALRDHCYAGEDINVNSSNNE⋯⋯．GL．I鞋SSSIDCMQQRIS．．．．．．．DCSNSHFSMQQRMCH⋯⋯DYHEFSYSNNYEGNNG}她HD．PCSlⅣK3FNNS．．．．⋯．．．PNANKEFIRGGRCSVDLNDGTNRFMSNSDND．．．．．．．．．．．．．NMLSYQO；tMLKAENTALRHSOSYKSECNTSLKEC：SSGRRSTSIHSTEKQSMESAGS,ⅫIPEVITVDDHEEDEVNDDGDDFMASTCSSAHiNINGFREWUSbox；黧KPLRAG6：：：：：：：：SnA6CA鞴AVSP纛TTPSA蓊SASFS“W哆ESESSD‘8S；MSS：：：：：跳EA9PL．罐V⋯HS：竭GG3RDGRAANGSNNDSLTSTSAEDSDGLESGSSGKGVEEAPALPFYD—BGLQSSGGRH⋯⋯．．．．P⋯．．．．P脒D●lG．K：ATATATA!ATSASIg．DGMGSS⋯⋯SFALGSDS．．．．PVDCSSDGAGREQPFIDFFSGG．．．．．．STSTRFDSNGNGL．．．．．．．RSSHAE．．⋯．TSAENS．．．．．．．．．TTLsTssETATTPs：EDG⋯SCDQPF．．rD■SAPSSETI．．．KTTTTT．．．，．．DQVSSLAS．．．，．．’DJSADSSTDTTSADDINEDDH．．AsP工"NQ赣啊TTSGQGSY．．．K曩．T⋯．．EHVSVSAD⋯⋯DSSSD．．THHSGSPDIIQD．H．．D⋯No参姆疆NNSGKSC⋯，KTTTAS⋯．．．SPSSA$．．．．．．．．．STSTSNS[．EANCFSDQGNST，．TsDHPN．”D■CGNGTYQNSR．KT=I妻D．．⋯．S$SS$STCVPRDHLSSNTTSNS％q￡VNCFTDLGIG．．．AsDRPQ霉V罩：．el●cGN．⋯．．．RDESLLS⋯⋯．SLAGN．．⋯⋯．CAQNSTALVSSSGIVEGHG⋯．．．ERPS弛啊SGGQGRCE．．．s；PQ．．．．．．．．．SPPPPS．．．．．．．．．醑JPTSASDEISVDDSAHG．．．．．．．．RQPYF啦．．．．．．．．．．CNGTVQELG．．．．HHPQSSSD⋯⋯YNVHEGSAACISSHESNVNG⋯。CCIDRRI／}lFQDPNCK⋯图4：不同物种WOX2氨基酸序列多重比对图8587845758746S62679217216816710710612311111l11012412918425724323619317l188180184164202184276322313324260236261244255237268238349WOXLOsWOX2：水稻wOx2：ZmWOX2A：玉米WOX2A；AtWOX2：拟南芥WOX2；GmWOX2：大豆WOX；VvWOX2：葡萄WOX2；PhWOX2：牵牛花WOX2；SIWOX2：番茄WOX2；CaWOX2．鹰嘴豆WOX2；FvWOX2．草莓WOX2；CsWOX2：黄瓜WOX2和GbWOX2：银杏WOX2Fig．4MultiplesequencealignmemofWOX2geneaminoacidsequencesfromdifferentspecies．Nora：Abbreviations锄≈Triticumaestivum．Ta；At；G加孟-gDbiloba，Ob；Glycinemax，Gin；Htissativa，Os；及口mm／s，Zm；Arabidopsisthaliana，opersicum，Sl；Cicerarietinum，Ca；Fragariavesca，FvandCucumissativus，Cs．pA．RDQAQG10AGLG薯．A三Y：QLNSAMSCGSTHSQGN二HE3AQPM￡ENREAS0SMYLMNSQIMVTPINp—QPEL阿IENPHMYPV0FIAReGNGIAQATANCGCALAG．CATG．0YRASIAG．翌M=TGSNP．N．YTMTG￡SI．S．MTMRHMM．C．TKITGgK．T．ADKTN0RNQPQSTPSRTRA口．Gr“KVMSKPR0A0EVIFVE?AVXAKG60S0TEGREKGLKASMHESPKSKR0TpOGERnDPTRSNE．MKHYVPRV．RTAp0TRR，J．P￡VCYR．FYG．RIAVMKRSPRG三三VtuRVHIKGVMTYI，AIVS．-G．．．．．RGVGG．ALM0}n|OSG．ATSVI赶V．QPpp霉pSVLQ卜．LVLPV0MLQMLFLT▲APSPQVPNATQNKYVNQQ^vNPQ_口Q—口M?QAQPRYHNO口PY0．．H．．．．．H．T．L．，．SQQ-nvL—O—PK—Q．^o■Q乱k．叠；I∞和争p私_．蹋酗YV．TFYFL0”SS!YGS、G6．．瑶茜AVLIL“VVNASDEGNE口^一．=|一一雌一一一一0．．Q．．．．．．．∞．．NN．A，AM．，置-PE．V-PH．ANADSGSTXSN凡TQSQPQAA?A．GA．．V．AVA^v．^vnv．t^PA^vP尊嚣誊p^PHkk【illppk∞kkERGSGNHNTDTC 万方数据3．2小麦WOX5基因扩增以克隆得到的另一条WOX家族基因序列与拟南芥、玉米和水稻WOX5基因homeodomain区域进行比对，相似性分别为73．9％、95．O％和95．O％，因此推断该序列为部分小麦WOX5基因。用该序列在NCBI数据库中对小麦的ESTs进行Blast搜索，结果得到2条相互重叠的小麦EST片段，GenBank登录号分别为CJ629269．1和CJ520549．1，将2条EST序列组装拼接，得到一条804bp的序列(图5A)。再通过热不对称交错PCR扩增得到砌粉基因的5’区域(图5B)。A■————■—■■———■■———■一a&29269；i■●———■●—●——■■■■■■■●■■■一cJ520549；{；l一般lqli5’[二]■—■■—■曩匦匦圈菡函圈函圈圈圈墨圈隧圈3’lHlll0盐Forrdll-DYtBM123CM12s00hp200bp70clbp_．wOObit—_．图5小麦TaWOX5基因克隆方法和扩增图注：A克隆策略，I兼并引物扩增保守区域；Ⅱ2条ESTs序列拼接；HI热不对称交错PCR扩增5’端。B热不对称交错PCR扩增图，M为DNAmarker：泳道1．3分别是随机引物AP4与特异引物P1，P2，P3进行3轮热不对称交错PCR的扩增结果。CWOX5在小麦基因组DNA和eDNA中的扩增图，M为DNAmarkerII：1为基因组DNA：2为cDNA。Fig．5CharacterizationofTaWOX5genes．Note：AThegenecloningstrategy．IPCRamplificationusingdegenerateprimers；IISequence雒sem_blyby2ESTsfi'omwheat；IIIPCRamplificationbyTAIL-PCR．BThePCRampliconsobtainedusing3setsofprimers：lanel，adaptorprimer4(AP4)+genespecificprimer1口1)；lane2，AP4+P2；lane3，AP4+P3；M，DNAMarker．CPCRamplificationuSillgWOX5F／Rprimers：lanel，genomicDNAofthewheatcultivarChinesespring；lane2，eDNAofthewheatcultivarChinesespring；M，DNAMarkerII． 万方数据在编码区域两端设计引物，采用常规PCR技术从中国春基因组DNA和反转录cDNA中分别克隆到一条特异片段(图5C)。通过这些方法我们成功克隆到小麦WOX5基因，挑取20个单克隆分别送测序发现WOX5在小麦中共有3种类型，分别命名为TaWOX5a，TaWOXSb和TaWOX5c(GenBank：KF038329-KF038331)，将WOX5编码序列和该基因的基因组序列比较分析，结果表明从小麦基因组DNA中得到的WOX5全长1029．1038bp，包含2个外显子和1个内含子，其中2个外显子长度分别为382．388bp和248．251bp，编码区长度为630．639bp，编码209．212个氨基酸，内含子长度为110．116bp，5’上游序列长度为351bp和3’下游序列长度为48bp。TaWOX5a，TaWOX5b和TaWOXSc的ORF长度分别为639bp，630bp和633bp，内含子长度分别为110bp，115bp和116bp(表3)。Bias&结果表明，克隆到的小麦WOX5第9至1J71个氨基酸区域为WOX家族保守的同源异型结构域(homeodomain)。将克隆得到的序列与水稻和玉米WOX5蛋白序列进行比对分析，发现TaWOX5a与OsWOX5和ZmWOX5B的相似性分别是78．8％和65．5％，并且TaWOX5s的homeodomain区域氨基酸序列与水稻玉米的该区域完全一致。将小麦WOX5与水稻WOX5、玉米WOX5、大豆WOX5、拟南芥WOX5、葡萄WOX5、菜豌豆WOX5和睡莲WOX5进行多序列比对分析，结果发现8种植物的WOX5在5’区域高度保守，而在3’区域差异明显(图7)。并且可以得出WOX5基因具有WOX家族现代进化支所特有的homeodomain、WUS-b0X和EAR-like[1卿三个结构(图6)。homeodomainWUShotEAR．1ike◆蝌oxs[—■—●二二二二—[]蛩]21z一脚[■●■【二二二】[]翌]200zmw。xsn[】■—●二二二二二】【二二—口："EmWOX5A[】●——[二二二二二二二二二]—二二蠢[二]辨蝌oxs[二】■■■[二■[二]翌酒19s图6WOX5蛋白的结构域示意图注：红色表示homeodomain；蓝色表示WUS-box；绿色表示EAR-likeFig．6StructureofWOX5proteinsinwheat，rice，maize，andArabidopsis．Thehomeodomain(red)andtheWUS-boxmotif(blue)weresameasinFig．3．TheERF·associatedamphiphilicrepression(EAR)motif(green)WasalsodefinedinastrictsenseasL．【ED】-L一[RST]-L．24 万方数据：a鼢X5aTa钧碧孙，aWOXSr0eWeXSZ口WOXSB乙矗WOX5AA￡Wt}x5讥钧X5GⅡWOX5FsWOX5N，W冉X^TaWOX，aTaWOX3bTaW％X5cOsWOXSZ嚣★蚺XS融Z$钧XSAAtWOXSVvWOXSb嚣一0X，PsWOX5Njwox5⋯⋯⋯⋯⋯。．．．⋯⋯⋯⋯⋯髓A终⋯⋯⋯⋯⋯．，．⋯⋯⋯⋯⋯燃溜．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．蠛^：．S⋯⋯⋯⋯⋯。．．．⋯⋯⋯⋯⋯燃：0⋯⋯⋯⋯⋯。，．．⋯⋯⋯⋯⋯黼二S＆A置A兔A5’嚣《：：‘只：基￡5基0暑5最蓑0抟：XSSD[EAP：MDTF．A}S⋯⋯⋯⋯⋯。。f五00曩i．托。鑫蔓∑．}≥I基0l：厶}⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯g：￡A⋯yS0■l强G⋯⋯．⋯⋯⋯。．．．．．M：￡：⋯LSefCIiSS⋯．⋯．⋯．⋯．．YOK0}：X?￡SS燃FS￡F：MiSS蚺≯}0j鼻；#rt：f：’￡?aWOXSa潍：姆0⋯．．．．．YV熏F．VAl：ToWOXSbP^：tf0⋯，．．．．YVI!I]V't二l。：Tdwoxs‘pl：≈嚣⋯⋯．．Tv|}￡￥疆003w母X，嬲：，嘲X．⋯⋯．TV摹0rliZoWOXSBHR二??e⋯⋯，．Iv曩；铲1：ZEWOXSA曼鬟二。+就l：潞孵婚i张≥r1：AtWOX5．⋯，{⋯⋯e}l键涔疆：VvWOXS．．．．z．．．．s?：蹦黻l；C嚣WOX5⋯⋯．⋯．．矗≯≤：：s婶P5WOX5⋯．．■⋯⋯HAZF0x?‘?I×翱)w馘5。⋯、⋯⋯：i_乞袁0{I矗3iaWOXSh．VA?～I《．1ikoY，10；j{≯^S丸SA≥：￡V≤。}键IS?弦R参取；骥蹦删|!壁j，既段件激硝哗．．：貔琵I?翻{垂}l懈iw．-'(dtwnan耀w0谬．}．￡j秘．踉R．qj．硼矗I瞄Ⅳ￡—锰P．P．葛5K暴．嚣^嚣．5Yx，蠢蒜礓LVo嵇．P．￡s鬟晏．葚AA。sY：．穗礓wL∞．p。Es黼．g觚。sK．髓^_Ll越囝牵．p．￡sx3．i怂．二Yi．1辩^馨’赶—i≯；po聱s甏曩爹霉盘囊套；Ysj聋冀3囊鞋囊W曩0．C￡．．0景r：§豫§．Ge．，0lP：Kl薅S．G￡．，0嚣VE．IVl，j；_；Gj．．EKV醛强穗0SGi?；E#V￡&鹊以R嫣^S，。12螓．．A10*NOYi．燃．．1．1：；．．。l二E．。ms⋯．．#0：．。VlVX⋯．一：r取。．LOS“G0．．S3S7．：'}：．X7⋯PAP!b⋯gH．．奇：嚣》．豁．基．套XS置．三j强图7：不同物种WOX5氨基酸序列多重比对图每，《94j正§{0巷。奄，E3娃髓‘蠢12{iZZi22l2ll13l强i0§l04l0j112l∞l》tl00l89i葛Z2∞2S3l73l鹞i59l6，ij基2122092i0000：33j埘l95i79l了?24￡l争0注：TaWOX5a,TaWOX5b，TaWOX5c：小麦WOX5s(本研究克隆序列)；OsWOX5：水稻WOX5；ZmWOXSA：玉米WOX5A；ZmWOX5B：玉米WOX5B；GmWOX5：大豆WOX5；AtWOX5：拟南芥WOX5；VvWOX5·葡萄WOX5；PsWOX5：菜豌_ff_WOX5；NjWOX5：睡莲WOX5F追．7MultiplesequencealignmentofWOX5geneaminoacidsequencefromdifferentspeciesNote：TaWOX5a,TaWOX5b，TaWOX5c：WOX5ofTriticumaesutivm；OsWOXS：WOX50fOryzasafiva；ZmWOX5A：WOX5AofZeamays；ZmWOX5B：WOX5BofZeamays；GmWOX5：WOX5ofGlycinemax；AtWOX5：WOX5ofArabidopsisthaliana；VvWOX5"WOX5ofV／t／svinifera；PsWOX5：WOX5ofPisumsativum；NjWOX5：WOX5ofNymphaeajamesoniana；25越鼬黔：；}”鼬泓粼泓枞觚姒蕊灞馓{|||躲瀚一氏一敞怂～壮kW戏～瓤■ry取往一曼11耀蠼瘫111111￡￡￡E￡￡￡QQ．．1●“涨∞强V-^“∞M“∽∞K扎滞矾铽乳≥：孤乏：；舱非飙时艨盼姘舱勰撬蜡t_‘ 万方数据3．3WOX5基因在小麦近缘属物种中扩增和结构分析利用小麦WOX5扩增引物，我们从小麦近缘属材料，包括基因组AA，SS，S1S1，SbSb，S5S5，S511S511，DD和AABB植物的基因组DNA中扩增出WOX5基因(图8，GellBank：KF038332-KF038372)。测序结果表明，42条普通小麦及其近缘属材料WOX5基因序列的长度为742．762bp，编码区长度为624．639bp，由2个外显子和1个内含子构成，共有5种类型，其中基因组AA和DD各有1种类型，分别标记为A和D；基因组SS有2种类型，为S．I和S．II；基因组S1S1，SbSb，S3S3和S8hS5h同为一种类型，标记为S．III；AABB基因组有2种，分别同A和S．I；普通小麦AABBDD基因组的3种类型，分别对应A、S．I和D(图9)。利用clustalW软件对克隆到的普通小麦及其近缘属材料WOX5基因进行多序列比对分析，分别对基因的全长、SNP位点和插入缺失变异数目进行统计分析，结果见(表3)。26AABBA．蛆BDD图8WOX5基因在小麦族植物中的PCR扩增Fig．8PCRamplificationofWOXSsinTriticeaeplants+l}289‘597+749■■■●■■■—■●■■■●—————-l■—●■—■■●ATcl，^、参TAIG，，，，7、、、、／＼、，，、．，’^AB．1ABD．I⋯啊了派：C∞霞⋯⋯⋯⋯霸1．．．昧一一旗^瞎一一端^又一一一一溉^⋯■■觏∞瞄黧⋯⋯⋯⋯^又G暑鑫C曩⋯e蠢⋯e图9小麦族植物WOX5基因序列差异分析Fig．9GenevariationanalysisofWOX5sgDNAinwheatanditsrelatives． 万方数据表3小麦族植物WOX5基因序列全长、SNP位点和插入缺失变异数目统计表3．4构建系统发育树3．4．1WOX2基因系统发育树的构建目前，WOX2的研究已经设涉及到许多物种，为进一步揭示和归类TaWOX2，通过NCBI数据库公布的来自水稻、玉米、大豆、拟南芥、葡萄、牵牛花、银杏、番茄、鹰嘴豆、草莓和黄瓜的WOX2序列为基础，进行系统发育树的构建，这些WOX2涵盖了单子叶和双子叶植物，包括一些模式作物，具有一定代表性。采用Mega4．0构建系统发育NJ树(图10)，从图中可以发现，WOX2基因中单子叶植物27 万方数据聚到一类，双子叶植物聚到一类。TaWOX2与水稻和玉米WOX2同为单子叶植物，相似度较高，聚为一类。双子叶植物大豆、拟南芥、葡萄、牵牛花、番茄、鹰嘴豆、草莓和黄瓜聚为一类。银杏单独聚为一类。卜————叫0．1图10WOX2基因的NJ树Fig．10Neighbor-joiningtreeofWOX2genes．3．4．2WOX5基因系统发育树的构建为阐明WOX5基因在小麦及其近缘属植物中的进化关系，我们利用在小麦族植物中克隆到的WOX5序列中的代表不同物种的29条构建系统发育树。采用Mega4．0【50】构建系统发育NJ(neighbor-joining)树(图11)，从图中可以发现，来自小麦族WOX5的29条序列聚为一大类，不同基因组(A，B，D)分别聚到不同的分支。来自A基因组的基因包括乌拉尔图小麦(AuAu)和一粒小麦(AmAm)，但是它们没有聚到一起，TaWOX5a与乌拉尔图小麦聚到一起；所有来自节节麦(基因组DD)的基因和TaWOX5c聚到一个分支；TaWOX5b与来自四倍体小麦(基因组AABB)的基因聚到了一起；山羊草属Sitopsis组包括拟斯卑尔托山羊草(SS)、西尔西斯山羊草(S5S5)、高大山羊草(StSl)、双角山羊草(SbSb)和沙融山羊草(S幽S3h)，从NJ树中可以看出拟斯卑尔托山羊草是山羊草属Sitopsis组与四倍体小麦关系最近的物种。 万方数据轴强94缱酊秘妒_．娥删做泓3卿s．一．s&，romwms觎掰，势)0fs·■，巍删联ss4粥)。1s，■。妫翩姗懈抬(飘S铋360>’S‘叠细爆咖觏604m3)Is，童埘删cPlS鳄I柏)丽'———一s10、删锻5钞14S)?lL———一SlA．卵吖嫡《Pl599145)妒蔗赫∞崩扫陬7∞s．■bJcomss《clae4D柚Z加譬踟如警．蕊occon斜蝤27)ABr姗脚妯警．幽删钟蝴l田’lAz莉潞cof侧妯孽，口|：够蚋僻{ls溯AB工鲫脚蚰警．aurm(carl，l鳓ABT船毽蚋黼s西锤．摩∞钟蹦d缸(AS28S)j嘞T烈棚(Cs)勋撇D■+raunchYl(As23确DA。tauzck甜(xs2393)D，1．自嚏蹴融《AS23哟DA．缬婚幽静fAs2404)一D■。utusch#fAS2395)D^囊口j础∞2407)ABDr能蝴㈣TaWOX5aAZ肭僻425313)AT嗍{疆4283t4)’IS量妒触僻l如酬豹酾S蠢．删拗跏锻554298)S童铡临妇cPl5．s4299)IS■．删帕妇群393492)71’S■，肇撇觎4S7笛S)ABDr埘smm(cs)Ta历O．UbAB￡舶髓赫s涵孽．飙衡瀚cPl35546s)}———————————一渊暇418580)SDSB妒眦诺肇蚴cPl560752)1．聊跏妇饿蝴僻5605瑚13图II小麦族植物WOX5基因的NJ树Fig．1lNeighbor-joiningtreeofWOX5genesinwheatanditsrelatives．此外，根据数据库已有的其他物种的釉硒基因，我们采用Mega4．0构建系统发育NJ树，结果如图12。从图中可以看出小麦WOX5基因与单子叶植物水稻和玉米WOX5基因聚到一类，其他双子叶植物大豆、拟南芥、葡萄、菜豌豆和睡莲聚到一29 万方数据I--————叫0．鲣3．5原核表达图12不同植物WOX5基因的NJ树Fig．12Neighbor-joiningtreeofWOX5genesindifferentplants．{}}该醛利用PCR扩增的方法，在TaWOX2两端分别引进的酶切位点NdeI和EcoRI，然后将两端引入了酶切位点的TaWOX2连入pET-30a原核表达载体，重组质粒命名为pET30a．TaWOX2。再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。在30℃，0．5mM的IPTG条件下诱导3h．5h，裂解细菌提取蛋白，在SDS．PAGE电泳上分离得到大小约为34kDa的融合蛋白，如图13。同样的方法，我们将TaWOX5c连,KpET-30a原核表达载体，重组质粒命名为pET30a-TaWOX5。然后将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。在30℃，0．5mM的IPTG条件下诱导2h．6h，在SDS．PAGE电泳上分离得到大小约为26kDa的融合蛋白，如图14。 万方数据l23456M97．2kDa66．4kDa44．3kDa29．0I‘Da图13pET30a-WOX2重组蛋白的表达注：1未诱导I拘pET30a；2，诱导3hi}qpET30a；3，未诱导ff'JpET30a-WOX2；¨，分别诱导3h,5h的pET30a-WOX2；6，阴性对照层cobBL21(DE3)；M，低分子量蛋白质marker(TaKaRa)。箭头指示目的蛋白。F适．13ExpressionofapET30a-WOX2fusionprotein．Note：lanel，uninducedpET30a；lane2，inducedpET30afor3h；lane3，uninducedpET30a-WOX2；lanes4-5，pET30a-WOX2inducedby0．5ramIPTGfor3and5hours，respectively；lane6，negativecontrolofE．coliBL21∞E3)；M，ProteinMolecularWeightMarker(LowXTaKaRa)．Thetargetproteinisindicatedwitharrows．123456M97．2kDa66．4kDa443kDa29．0kDa20。lkDa图14pET30a-WOX5重组蛋白的表达注：1未诱导的pET30a；2，诱导3hl}qpET30a；3，未诱导的pET30a-WOX5；倘，分别诱导2ll，4ll，6h的pET30a-WOX5；M，低分子量蛋白质marker(TaKaRa)。箭头指示目的蛋白。Fig．14ExpressionofapET30a-WOX5fusionprotein．Note：Lane1，uninducedpET30a；lane2，inducedpET30afor3h；lane3，uninducedpET30a-WOX5；lanes4--6，pET30a-WOX5inducedby0．5mMIPTGfor2，4，and6hours，respectively；M，proteinmolecularweightmarker(10、Ⅳ)(TaKaRa)．Thetargetproteinisindicatedwithanarrow．31 万方数据 万方数据 万方数据4讨论4．1TaWOX2和TaWOX5s是小麦WOX家族的成员在本研究中，我们从小麦中克隆到两个WOX家族成员，WOX2和WOX5，将其连入原核表达载体，成功表达了重组蛋白。并通过荧光定量PCR分析了这两个基因在普通小麦中的表达模式，对进一步了解该基因的功能提供了依据。TaWOX2和TaWOX5s基因的核酸序列分别与水稻和玉米具有很高的同源性，特别是在5’端。系统进化分析也同样支持这个结果。蛋白序列比对分析发现，TaWOX2具有WOX家族现代进化支的2个保守结构域，分别是homeodomain和WUS．box；TaWOX5具有WOX家族现代进化支的3个保守结构域，分别是homeodomain、WUS．box和EAR．1ike。TaWOX2的homeodomain保守区域氨基酸序列与OsWOX2的相似性是89．6％，与ZmWOX2A的相似性是85．1％。TaWOX5a的氨基酸序列与OsWOX5的相似性是78．8％，与ZmWOX5B的相似性是65．5％，而且TaWOX5s的homeodomain区域氨基酸序列与水稻玉米完全一致。从以上结果可以得出，TaWOX2和TaWOX5s都是小麦WOX家族的成员。4．2WOX2和WOX5在小麦基因组中的以多拷贝形式存在研究表明[18,21,23】，WOX2在拟南芥和水稻中只有一种类型，在玉米中有ZmWOX2A和ZmWOX2B两种类型。普通小麦是异源六倍体，由A、B、D三套子基因组组成。因此，我们推断TaWOX2基因有可能和大多数小麦基因一样存在多个拷贝、多种类型情况，但本研究只克隆得到其中的一种类型。我们从普通小麦中克隆得到3种类型的WOX5基因，为了进一步了解小麦WOX5等位基因的分离和进化关系，我们分别从小麦近缘属植物中分离得到WOX5基因。这些来自于小麦二倍体近缘属材料的WOX5基因具有95％的相似性，但在这些WOX5克隆中也存在一定程度的差异。这些特异差异证明该基因在四倍体和六倍体小麦中存在多拷贝现象(表2)。系统进化分析表明，来自于不同基因组材料的WOX5基因分别聚到A、S、B和D分支，这些结果进一步验证了一些已经存在的事实：普通小麦A基因组和D基因组的供体分别来源于乌拉尔图小麦和节节麦；拟斯卑尔托山羊草是与普通小麦B基因组关系最近的二倍体物种。 万方数据4．3TaWOX2和TaWOX5s蛋白的功能据前人报道，在拟南芥，玉米和云杉中【18，21，531，WOX2基因都与其胚胎形成有关。由于小麦种子发育与胚发育的过程是一致的，而且在胚胎成熟后期TaWOX2的表达量开始降低(图16)，所以很有可能TaWOX2在种子发育过程中的表达水平即反应了其在胚发育过程中的表达水平。因此，我们推测TaWOX2基因和小麦的胚发育相关。此外，WOX2在云杉和葡萄中可以作为体细胞胚胎发育的分子标记基因，是因为WOX2在胚性愈伤中大量表达而在非胚性愈伤中不表达或表达量很低口4，541。虽然我们在小麦的胚性愈伤中检测到TaWOX2的表达，在非胚性愈伤中未能检测到表达，但在胚性愈伤中的表达量相对于种子很低(图16)。这表明TaWOX2可能与体细胞胚胎发育相关。Kamiyaeta1．(2003)和Sarkareta1．(2007)分别发现WOX5在水稻和拟南芥中参与调节分生组织的发育，它主要在根端分生组织的静止中心表达，对干细胞的形成及维持发挥了重要的作用。TaWOX5s在小麦根中有较高的表达，而在其他组织中几乎不表达。一般来讲，基因在细胞或器官的特异位置的表达对它的功能有重要影响，所以检测特异基因的具体表达时间和表达部位是了解该基因功能的有效方法。基于上述原因，我们推测TaWOX5s可能与小麦根的形成和发育有关。TaWOX5s在愈伤组织中大量表达，而在激素NAA，6-BA，玉米素和激动素的诱导下，愈伤组织开始分化，TaWOX5s的表达量逐渐降低。这个结果与拟南芥，苜蓿和葡萄的研究结果在一定程度上一致：在拟南芥中，根经过IAA，2，4．D处理后AtWOX5的表达量上调【33】；在苜蓿中，生长素诱导MtWOX5基因大量表达，而细胞分裂素使MtWOX5的表达量降低【55,56]；VvWOX5被检测出在根和含有生长素的培养基诱导的愈伤组织中表达【54】。以上研究表明WOX5基因的表达与激素的调节有关，激素包括生长素和细胞分裂素，它们调控着有关形成和维持根端干细胞的相关基因表达，比如嬲基因。因此，我们得出生长素2，4．D能够诱导劢脚的表达，而在NAA，6-BA，玉米素和激动素的共同作用下，TaWOX5的表达量逐渐降低，愈伤组织开始分化。 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万方数据致谢本论文是在魏育明研究员的悉心指导下完成的。感谢魏老师在实验和生活中对我的指导与关怀，感谢魏老师一直以来对我的宽容、理解与支持，在此向老师致以最深切、最崇高的敬意。在我进行实验阶段和完成论文期间，江干涛老师在理论知识、实际操作和生活中给予我极大的帮助、支持和关怀，感谢江老师三年来潜移默化的影响以及在实验和论文完成中给予的帮助，在此向老师表示由衷的感谢。感谢小麦研究所刘登才老师、兰秀锦老师、颜泽洪老师、王际睿老师、陈国跃老师、祁鹏飞老师、刘亚西老师、李伟老师，蒲至恩老师、彭远英老师，邓梅老师、陈庆老师在我学习和实验过程中给予帮助和支持!感谢科研助理唐华萍老师和陈雪姣老师在实验技术方面耐心地指导和细心地讲解，也感谢她们在学习生活中给予的关心与帮助。感谢博士生马建师兄一直以来对我实验的指导和帮助，从刚进实验室一无所知他耐心细致的讲解与演示让我受益匪浅；感谢张晓伟师兄在完成实验和论文过程中给予的指导与帮助，他细致谨慎的实验态度，扎实的理论知识，勇于探索的精神让我备受启发：感谢冯俊彦师兄在实验和生活中的关心与帮助；感谢刘泽厚、陈时盛、杨剑、周勇、颜红海、刘诗航等师兄师姐；感谢赵全志、莫洪君、唐雪琴、蒋云峰、文道军、乐承星、刘安军、王钊等同学；感谢王长水、王秀英、曹雪、危龙、杨强、何涛、李丽婷、吕思宇、张雄等师弟师妹；感谢他们在实验过程中给予的关心、帮助与支持，有他们的陪伴实验生活不再单调，而是丰富多彩。三年的学习生活离不开小麦研究所这个团结、友爱、互助的大集体，再次感谢小麦研究所的领导以及全体老师对我的关心和帮助!感谢一起走过六年的所有08级本硕班的同学们，特别是室友岳玲玲、邓龙群、李燕群，感谢并祝福你们!特别感谢我的父母和亲人在学习和生活中给予我关怀、支持和理解。最后真诚感谢所有关心、支持与帮助过我的亲人、老师、同学和朋友。 万方数据在读期间发表论文1．ShanZhao，Qian—TaoJiang，JianMa,Xiao—WeiZhang，Quan-ZhiZhao，Xiu—YingWang，Chang-ShuiWang，XueCao，Zhen-XiangLu，You—LiangZheng，Yu-MingWei木．CharacterizationandexpressionanalysisofWOX5genesfromwheatanditsrelatives．Gene．2014，537(1)：63-69．(SCI，IF=2．196)2．ShanZhao，Qian-TaoJiang，JianMa,Ji—RuiWang，Ya-XiLiu，Guo·YueChen，Peng-FeiQi，Zhi-EnPu，Zhen·XiangLu，You-LiangZheng，Yu-MingWei木．CharacterizationandexpressionanalysisofWOX2homeodomaintranscriptionfactorinAegilopstauschii．GeneticsandMolecularBiology．(投稿中)3．Qian-TaoJiang，JianMa，ShanZhao，Quan—ZhiZhao，Xiu-JinLan，Shou-FenDai，Zhen-XiangLu，You—LiangZheng，Yu-MingWei幸．CharacterizationofHMW-GSsandtheirgeneinactionintetraploidwheat．Genetica,2012，140：325—335(SCI)4．JianMa，Qian-TaoJiang，Quan—ZhiZhao，ShanZhao，Xiu-JinLan，Shou-FenDai，Zhen—XiangLu，ChunjiLiu，Yu-MingWei，You-LiangZheng木．Characterizationandexpressionanalysisofwaxyallelesinbarleyaccessions．Genetica,2013，141：227—238(sc05．Qian—TaoJiang，Xiao—WeiZhang，JianMa,LongWei，ShanZhao，Quan-Z11iZhao，Peng·FeiQi，Zhen·XiangLu，You-LiangZheng，Yu—MingWei*．Characterizationofmgh—molecular-weightgluteninsubunitsfromEremopyrumbonaepartisandidentificationofanovelvariantwitllunusualhighmolecularweightandalteredcysteineresidues．Planta，2014，1—11(sci)6．Qian—TaoJiang，Quan-ZhiZhao，Xiu-YingWang，Chang—ShuiWang，ShanZhao，XueCao，Xiu-JinLan，Zhen—XiangLu，You-LiangZheng，Yu·MingWei枣．Characterizationofx-typehigh-molecular-weightgluteninpromoters(x-HGP)fromdifferentgenomesinTriticeae．SpringerPlus，2013，2：1527．Qian·TaoJiang，JianMa，Yu-MingWei，Ya-XiLiu，Xiu·JinLan，Shou·FenDai，Zhen-XiangLu，ShanZhao，Quan—ZKZhao，You·LiangZheng奉．NovelvariantsofHMWgluteninsubunitsfromAegilopssectionSitopsisspeciesinrelationtoevolutionandwheatbreeding．BMCPlantBiology,2012，12：73(scI)41