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《坛紫菜碳酸酐酶基因的克隆、表达及酶活性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、坛紫菜碳酸酐酶基因的克隆、表达及酶活性分析1,2311111郇丽,贾兆君,张宝玉,牛建峰,林阿朋,何林文,王广策(1.中国科学院海洋研究所,山东青岛266071;2.中国科学院大学研究生院,北京100049;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连116024)摘要:以坛紫菜丝状体为材料,采用RACE方法获得坛紫菜碳酸酐酶(CA)基因的全长cDNA。该cDNA全长1081bp,具有一个825bp的开放阅读框,可编码274个氨基酸。序列同源性分析显示该cDNA序列推导的氨基酸序列与其他物种的碳
2、酸酐酶具有较高的一致性,其中与条斑紫菜的一致性达到96%。氨基酸序列分析表明该蛋白为β-CA,含有两个CA活性位点,无跨膜结构,可能存在一个信号肽将其定位到叶绿体中,与藻类和细菌聚类。原核诱导表达得到一个72kDa左右的融合蛋白,酶活测定结果显示此蛋白具有碳酸酐酶活性。该实验对进一步深入研究坛紫菜CA的功能及坛紫菜碳代谢、光合作用等生理过程具有重要的参考价值。关键词:坛紫菜;碳酸酐酶;序列分析;原核表达;酶活性中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1000-3096(2014)08-0008
3、-08doi:10.11759/hykx20121105002碳酸酐酶(carbonicanhydrase,CA;EC4.2.1.1)是要分布于潮下带,体积较小,钻入贝壳等含碳酸钙一种催化CO2和HCO3之间相互转化的含锌金属酶,的基质中以度过高温。叶状体主要分布于潮间带礁[1-2]转化效率较高。该酶分布非常广泛,在动物、植石上,呈薄膜状。坛紫菜是典型的潮间带海藻,同时[3]物、藻类、古细菌和真细菌中均有发现。碳酸酐酶它具有基因组较小,生长周期短,进化地位特殊,遗是CO浓缩机制(COconce
4、ntrationmechanism,CCM)[12-14]22传背景较为清晰等特点,已逐渐成为海洋藻类中重要的组成成分,主要参与羧化和脱羧化反应,研究的一种模式生物,适合用于藻类的生理生化及可将无机碳从胞外运送到高光合作用活性细胞中,分子生物学的研究。[4-5]或将其从高呼吸活性的细胞中转移出来。它能够本实验克隆了坛紫菜碳酸酐酶cDNA序列的全提高细胞内Rubisco羧化位点附近的CO2浓度,提高长,对其做了系统进化分析,并将其在原核表达系[6]光合效率并抑制光呼吸。此外,碳酸酐酶还在pH统中进
5、行了融合表达,检测出表达的蛋白具有碳酸调节、光合CO2固定、离子交换、呼吸作用和生物酐酶的活性,对进一步研究其功能奠定了基础,同[7-8]合成等多方面起着非常重要的作用。时对深入研究坛紫菜碳代谢、光合作用等生理过程依据晶体结构及亚基的组成,目前已知的碳酸具有重要的参考价值。[3]酐酶主要分为α-CA、β-CA、γ-CA3个基因家族,另外在海链藻Thalassiosiraweissflogii和Thalassiosira1材料与方法[9-10]pseudonana中发现了δ-CA,在硫杆菌Hal
6、oth-1.1材料的获得[11]iobacillusneapolitamus中发现了ε-CA。这5种类坛紫菜丝状体为本实验室(中国科学院海洋研究型的碳酸酐酶在一级结构上没有明显的序列相似性,[2]所藻类分子生理与发育调控实验室)培养藻株,用含似乎独立进化。除了ε-CA外,其他4种碳酸酐酶[8]在藻类中均有发现。收稿日期:2013-01-04;修回日期:2013-03-12坛紫菜(Porphyrahaitanensis)属于红藻门(Rhod-基金项目:公益性行业(农业)科研专项(200903030
7、);国家自然科学基ophyta)、红毛菜目(Bangiales)、紫菜属(Porphyra),是金(41176134);海洋公益性行业科研专项项目(201105023-7);国家我国南方海域特有种,具有较高的经济价值和营养973计划前期专项(2011CB411908)作者简介:郇丽(1986-),女,山东临沂人,硕士研究生,研究方向为价值。它的生活史属于特殊的异型世代交替,包含叶藻类分子生物学,E-mail:huanli86@gmail.com;王广策,通信作者,状体(单倍配子体)和丝状体(二倍
8、孢子体)。丝状体主电话:0532-82898574,E-mail:gcwang@qdio.ac.cn8海洋科学/2014年/第38卷/第8期有加富培养液的无菌海水培养,培养基每周更换一表1本实验所用引物2Tab.1Primersusedinthisstudy次。培养温度为18℃,光强为40µmol/(m·s),光暗引物序列(5’-3’)周期为L︰D(Light︰Dark)=12︰12,持续通入过滤PhCAFGACAACTGGCTGACGCACAT除菌后的空气。PhCARCCACATCCACACA
