大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆-表达和酶学活性分析

《大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆-表达和酶学活性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆表达和酶学活性分析摘要：利用RT—PCR技术，从大豆叶片总RNA中扩增了乙醇酸氧化酶基因的cDNA序列，克隆到pMD19-Tsimp1e上，进行测序，然后将乙醇酸氧化酶的cDNA克隆至原核表达载体pRSET—A上，转化E.co1iBL21,并对该基因在E.co1i中的表达进行了研宄。关键词••乙醇酸氧化酶；基因克隆；原核表达；酶学活性中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：0439-811401-0172-05CloningandExpressionofSoybeanGlycolateOxidaseGeneinEscherichiaco

2、liandEnzymeActivityAnalysisLIYingl,2,KANGuo—shil,SUNWen-1i2,uYu1L，2eMAbstract：ThecDNAsequenceofg1yco1ateoxidasewasamplifiedfromthetotalRNAofsoybeanleavesbyRT—PCR，andthenclonedintocioningvectorpMD19—Tsimple.Aftersequencing，theGOgenewastransformedintoEscherichiaco1iexpressionvectorpRSET—

3、a.SDS—PAGEanalysisprovedthattherecombinantE.coliBL21expressedthepredicted40.8kDglycolateoxidase；andtheenzymeactivitywasalsodetected.Keywords：glycolateoxidase；cloning；expression；enzymeactivity乙醇酸氧化酶［1］广泛存在于菠菜、甜菜、豌豆、西葫芦、莴苣和微生物中，是植物光呼吸过程中的关键酶，在植物体内，与丝氨酸转氨酶协同作用，导致H202积累，杀死病原菌并诱导植物体产生获得性抗性。

4、乙醇酸氧化酶在过氧化氢酶和乙二胺的存在下能高效催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸是一种重要的有机化工中间体，是合成香兰素、尿囊素、除草剂、羟氨苄青霉素等医药产品的前体。以G0为主要催化剂生产乙醛酸的方法具有成本低、污染小的特点，是目前生产乙醛酸的首选方法。国外已有利用E.co1i、酿酒酵母、毕赤氏酵母、汉逊多形酵母等表达菠菜乙醇酸氧化酶，并将其应用于生产乙醛酸的报道，国内对乙醇酸氧化酶基因的表达和应用的研究较少。1990年Ludt等［2］从兵豆叶片中克隆得到GO的cDNA,根据其核苷酸序列反推得到了氨基酸序列，共371个氨基酸残基，分子量为40833D,与菠菜GO同源

5、性为93%，其C端氨基酸残基为P_R_A_P_R_L，与大豆乙醇酸氧化酶非常相似，但未对其进行深入的体外表达研究和编码蛋白的酶学活性分析。因为以菠菜叶子中GO的含量和活性最高，所以国内目前仅有菠菜乙醇酸氧化酶在E.co1i、酵母中表达的报道，而未见大豆乙醇酸氧化酶表达的报道。探索在E.co1i中表达大豆乙醇酸氧化酶的方法，为比较大豆乙醇酸氧化酶和菠菜乙醇酸氧化酶的活性差异，为探索利用大豆乙醇酸氧化酶生产乙醛酸的可行性奠定了基础。1材料与方法1.1大豆叶片新鲜的大豆叶片品种为大白眉一3，采自实验室温室。1.2菌种和质粒pMD19—Tsimple载体购自TaKaRa公司

6、，其余质粒和菌株均为本实验室保存或构建。1.3工具酶和试剂逆转录试剂盒购自北京原平皓公司；T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、EcoRI和HindIII均购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Trizo1试剂购自盖宁生物公司。1.4引物引物Pl、P2根据GenBank登录号AB333790.1的GOcDNA序列设计，由上海生物工程公司合成。P1:5F—GAATTCGAATGGAGATCACCAATGTCAGCGAGTAT—3,为正向引物，P2:5，一AAGCTTTCATAATCTTGGCAATGCGCGGGGAAG-3"为反向引物

7、，为方便进行载体构建，在引物5,端分别设计了EcoRI和HindIII酶切位点。1.5大豆叶子总RNA的提取取新鲜叶片组织，按每100mg叶片加入1mLTrizo1的比例加入Trizo1，10746r/min,4°C离心10min,取上清，室温静置5min，加200三氯甲烷，振荡15s，静置2〜3min,10746r/min,4°C离心15min，取上清，加500(iL异丙醇混匀，室温静置10min，10746r/min,4°C离心15min，沉淀中加入75%乙醇1mL，振荡混匀后，6716r/min,4°C离心5min,弃上清，将沉淀室温静置5〜10min，加