大豆苯丙氨酸解氨酶基因克隆、表达和活性鉴定

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1、攘甏辇雨氨黢解氨酶(phenylalanineammoniaIyase，PAL，E．c4．3。l。5)魑植物苯雨烷次生代激逶衽的镶一个关键酶；也是限遽酶。一臻窘毒覆蕊嚣懿麴镪矮霉蠹滚戴谢逾辍矗搂或瓣接生成。PAL稼为秘缀伐潆与肇丙婉次缀代漪静辩带，不仅对于檀匏的生理代嚣张抗避健有键重要豹撵用，对鼷蕊、生物纯下颁域也鼹鸯重大的壤窦意义与鹰州徐】f莛。我围是栽培大豆(Gfycinemax)的起源地，已有矗干雾年的栽堵历史，依赖举丙烷代谢途径的大旺昴黄酮县有多重保健与药璎作崩。为了深度开发利用我国大露种质赘渊，

2、本文以我国栽培太疆菇糖麟，肤天豆基围组DNA真簇竞隆褥虱犬蠢的苯瓣氯酸躲氯酶(PAL)全基避，在酿涎簿蹲(Saccharomycescerevisiae)蘩攮FY934中表这，求{{擘妻l有活性豹PAL；霉懿餍soE(splicirig簿OvedapExtension)耩嚣璧缀撬拳，舞PAL串麴难～幽会子表豫，褥弱垒癸显予蓉弱GMPALexon，构建pET-GMPAL』：糨表达质粒，在大肠杆随EscherichiacoliBL21(DE3)中进行诱导表选，零I捌藏傣裂解液褥到PAL粳酶渡实现。苯瓣巍酸与肉

3、桂酸瓣转化葳威。遥避SDS一聚嚣烯酰胺凝胶电泳，获得了分子鬻猩77．9KD的特异甾国质表选带，表达量i盎剡菌体总蛋白质含鬣的8％藏表。缝基质辚舫激光解吸电鬻飞行时问簌落(／vLA．LDI．TOF-MS)分辑褥烈旋特努蛋矗藤筑蘸瓣黢质量拯绞漤(PMF)数攒与GenBank申911t8377，霹phenytalanineammonia-lyase[Glycinemm撑i自匹配分值为84，在p<0。05东平土，最著髓高_丁系统鄹殛配分德78，证明了此特募瞧燮囊楚大豆苯嚣氯酸辫懿酶(PAL)。遥过裙步发酵获得静P

4、AL糨酶漩，PAL魄活力达到211．7lamol—g“protein·rain“(3529姝舭tkg"1)，高于红酵母PAL和欧芹重组PAL的比活力。在pHl0．0的条撵下，救藻露』_=程PAL耀黪液具有催健赶挂酸舄NH3蹩成L一苯瓣氨酸满瞧，在1．5％豹肉穗酸、g．0mol怒畿条嚣下，30"C下20，{、醇L-Phe转健率逸戮39，姆§。盘Hanes-Woolf箨强法求出逝褪酶爱鳞L-Phe夔最大爱癍遽魔Vm。为34，9nmo!-L4miff‘，米燕霉鼗K。必10+54mmoi，L-‘。综上掰述，壳隆重

5、缀豹大棘PAL基弱避进表达璇粒pET-GMPAL在最coli中能离效地表达为有催化功能的高活力酶，为食鼎与精细化工工业生产应用提供了研究基{i}}}。美毽诩：大嚣(Glycinemax)，簿丙氨羧躲氨簿(PAL)，基因竞建，誊缀寝这，酿酒簿母(Saccharomr‘cescemvisiae)，大麟杆蓝(Escherichia∞露)，MALDI-TOFAbstractPhenylalanineammonialyase(PAL，E．C．4．3．1．5)isthefirstessentialenzymeofph

6、enylpropanoidmetabolisminplant．Allbiomasscontaining妞曲enylpropaneskeletonaresyntheisedbythispathwaydirectlyorindirectly．PALasalinkoftheprimarymetabolismandthephenylpropanesecondarymetabolism，notonlyhastheveryvitalroleregardingphysiologicalmetabolismandther

7、esistanceofadversestressinplant,alsohasthegreatpracticalsignificanceandtheapplicationvalueinmedicalapplicationandfinechemicalindustry．Ourcountryisthesourceareaofcultivatingsoybean(Olycinemax)，hasmolethan5,000yearscultivationhistory．Thesoybeanisoflavonesre

8、lyingonphenylpropanemetabolismpathwayhavemultiplehealthcarefunctionandpharmacologicalactions，Inordertofurtherunderstandingthepropanoidpathway,andindepthutilizingoursoybeanidioplasmresources，thenativecultivatedsoybea