当归苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆和组织特异性表达分析-论文.pdf

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1、13()一137草业学报第23卷第4期2O14年8月ACTAPRATACULTURAESINICAVoI．23，NO．4当归苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆和组织特异性表达分析雒军，王引权，温随超，李静。，张金林，夏琦。(1．甘肃中医学院药学院，甘肃兰州730000；2．甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室甘肃兰州730000；3．兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州730020)摘要：苯丙氨酸解氨酶(PAL)在高等植物苯丙烷类代谢中具有重要作用，与植物体内很多重要的次生代谢产物的合成密切相关。当归主要药效成分

2、阿魏酸是苯丙烷类代谢途径中的产物之一。为了探究阿魏酸生物合成和积累的机理，本研究克隆了当归苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)部分序列，运用荧光定量PCR方法分析该基因在当归不同组织部位的表达差异。根据已经克隆的植物PAL保守序列设计一对扩增引物，以当归叶片总RNA为模板，采用反转录PCR(RTPCR)方法扩增出PA_L片段并连接到pGEMTEasy载体上，转化大肠杆菌DH5，阳性克隆经PCR检测后测序，得到一段706bp的序列(登录号：KJOOO258)，内含终止密码子TAA，编码232个氨基酸，与OenBank中注册的

3、伞形科植物珊瑚菜等6个物种的PAL核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性都住8o以上；运用SYBRGreen荧光定量PCR方法，以当归肌动蛋白基因Actin为内参基因，检测PAL在当归不同组织中的表达量，结果显示PAL在叶片中表达量最高，其次是茎和根，叶片和茎中表达量分别是根中表达量的7．5和2．7倍。关键词：当归；苯丙氨酸解氨酶基因；基因克隆；荧光定量PCR；基因表达中图分类号：s567．239；Q943．2文献标识码：A文章编号：1004—5759(2O14)04—0130—08D0I：10．11686／cyxh2

4、0140416当归(Angelicasinensis)为伞形科当归属草本植物，以干燥根人药，具有补血活血，调经止痛，润肠通便等功效，为临床常用药]。甘肃是当归主产区，年栽培面积和总产量都占全国9O以上，当归适宜栽培在2000～2800m海拔的高寒阴湿地带l_2]。目前对当归栽培模式、当归生理特征、药材品质和产量形成进行了许多研究，王慧珍等[3报道连作当归比轮作当归的挥发油含量、叶片光合色素含量和光合特性显著降低，进而导致产量和品质下降；王田涛等l1研究发现当归／大蒜(Alliumsativum)间作能提高当归产量和

5、优等品比率，并能降低当归麻口病发病率；邱黛玉等报道当归种苗的大小影响生长过程中当归茎叶和根部蛋白质、游离氨基酸、可溶性糖含量的变化，进而影响成药期抽苔率，但对当归药效成分生物合成及其代谢调控的分子生物学机理尚未开展过系统研究。阿魏酸(ferulicacid，FA)是当归药材中含量较高的水溶性活性成分，为《中国药典》规定的当归质量控制指标之一]。现代药理研究表明，FA具有明显抗动脉粥样硬化，抗血小板凝集和血栓，清除亚硝酸盐、氧自由基、过氧化亚硝基，抗菌消炎，抗肿瘤，抗突变，增加免疫功能等作用]。FA为苯丙烷代谢途径生

6、成的中问产物之一，其主要生物合成途径是由苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia—lyase，PAL)催化L一苯丙氨酸(L—Phe)生成反式一肉桂酸(t-CA)，肉桂酸一4一羟基化酶(CH)催化反式一肉桂酸生成对一香豆酸(一Coumaricacid)，对一香豆酸经香豆酸一3一羟基化酶(C。H)作用生成咖啡酸(caffeicacid)，再以甲硫氨酸(S-腺苷一L甲硫氨酸)为甲基供体，在咖啡酸一0一甲基转移酶(COMT)的催化下生成阿魏酸(FA)¨8]。PAL催化L一苯丙氨酸(L—Phe)生成反式一肉桂

7、酸(一CA)，是苯丙烷代谢的第一步反应，也是其中的关键步骤之一ll。】。目前有多种植物的PAL已经得到克降，在药用植物中有朝鲜当归(Angelicagigas)[1、皱波天竺葵(Pelargoniucrispum)E12]、金银花(Lonicerajaponi一收稿日期：2014-01—03；改回日期：2O14一O3—14基金项日：国家自然科学基金项目(81060327，812606l6)资助。作者简介：雒军(1981-)，男，甘肃秦安人，硕士。E—mail：luojunnwnu@126．COI1]*通讯作者。E—

8、mail：kjk{pp@163．corn，jlzhang@lzu．edu．cn第23卷第4期草业学报2014年ca)Els3、黄芩(Scutellariabaicalensis)D4]、紫草(Lithospermumerythrorhizon)[引、黄芪(Astragalusmembrana—ceus)和丹参(Salviamiltiorrhiza)_】等，但