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《soe法对大豆苯丙氨酸解氨酶（pal）基因拼接的应用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、SOE法对大豆苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因拼接的应用研究第25卷第3期2006年8月大豆SOYBEAN科学SCIENCEVol_25No.3AUff.2006SOE法对大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因拼接的应用研究宋柬马会勤.陈尚武(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083;2.中国农业大学果树学系,北京100094)摘要利用SOE(SplicingbyOverlapExtension)法对大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)的两个外显子进行拼接,得至lJL完整的PAL基因,表明这种方法是有效可行的.这种技术是作为
2、对cDNA克隆的初步改进与尝试,节约了成本,有一定的应用价值.关键词SOE法;cDNA克隆;苯丙氨酸解氨酶(PAL)中图分类号S565.1文献标识码A文章编号1O0O一9841(2006)03一O228一O61989年,Horton等人提出了SOE法(GeneSplicingbyOverlapExtension,GeneSOEing),即通过复制时DNA链的交错延伸实现基因拼接[1].该方法是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,该技术使用简易.由于引物只需要与模板有效结合,尤其是5端序
3、列不必与模板完全配对,因此扩增引物的5端可以添加两种酶切位点以便于后期克隆[2].SOE法正是利用这一特点,使两个基因出现一个重叠区域,进而利用这段重叠区制造"长引物"(megaprimers),使基因拼接或重组得以实现【4],SOE原理示意图如图1所示.利用这一方法,把大豆中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的两个外显子拼接在一起,与从mRNA反转录为cDNA的技术路线相比,简化了克隆方法,节约了成本,降低了RNA污染降解的风险.1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料大豆(Gtycinemax(L.)Merr.)栽培品种东
4、北春大豆系列(北丰12)幼嫩叶片.1.1.2质粒和菌种质粒pGEM—T—EasyT载体试剂盒购自Promega公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a为本实验室保存.1.1.3工具酶及其它试剂限制性内切酶,T4DNALigase,ExTaqDNA聚合酶,PyrobestDNA聚合酶,dNTP,DL2000DNAMarker等购自TaKaRa公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(QIAquickGelExtractionKit)为QIAGEN公司产品,质粒DNA小量提取试剂盒购自泽星科技公司(北京);Trypto
5、ne和YeastExtract为OXOID产品;琼脂糖为西班牙产品;X—Gal,IPTG,氨苄青霉素等药品均为进口或国产生物试剂.1.2方法1.2.1大豆DNA提取纯化利用CTAB法进行DNA的提取纯化,稍有改进.原理方法参见文献[6].1.2.2引物设计与合成?收稿日期:2006—03—23基金项目:国家自然科学基金资助项目(Ieemnumber.30371005&39970469)作者简介:~(1980-),女,中国农业大学食品科学与营养工程学院,硕士研究生,主要从事食品分子生物学研究,电话:010—62733
6、986E--mail:songirlike@163.corn通讯作者:陈尚武,swchen@cau.edu.cn3期宋柬等:SOE法对大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因拼接的应用研究229外显子1引物序列:F1:5'一TTCATATGGAAGCAACTAATGB1:5'一AAGGAACTCATCAGGTAACTNdeI外显子2引物序列:F2:5'一TCCTTTTCAGATTCTTAAACGCTGGB2:5'一TTCTCGAGCTTGCATAGGTACXhoI重组PCR引物序列:F3:5'一GTGCTCTGCAGAAGGAAC
7、TCATCAGATTCTTAAACGCTGGAATATTTGGAAATGGAACTG一3'60bpB3:5'--CCAAATATTCCAGCGTTTAAGAATCTGATGAGTTCCTTCTGCAGAGCACCACCCTGTTTG--3'60bp其中引物F3和B3划线部分互补,为上海生工合成;常规引物F1和B1,F2和B2为赛百盛合成.1.2.3PCR扩增GMPAL外显子1,2的扩增采用25l的标准体系(表1).表1PCR反应体系Table1PCRreactionmixturePcR反应体系用量终浓度PCRrecflon
8、mixtureddH2Ol0×PCRBuffer(Mg2+plus)dNTP(2.5mMeach)MixturePrimer1(2.5pmol/M)Primer2(2.5pmol/tJ1)TemplateExTaq(5U/la1)14.75tJl2.5tJl1×2.0tal200taM2.5tJl0.2
