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《雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cdna克隆与表达分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析［摘要］贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoicacidoxidase)是二菇赤霉素生物合成途径上的关键酶，参与植物生长发育等重耍生物学过程。该文根据雷公藤转录组数据设计特异性引物，采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯酸氧化酶全长cDNA序列，并进行生物信息学分析；使用实时定量PCR(qRTPCR)研究基因的诱导表达水平。克隆得到TwKAO长度为1874bp,编码487个氨基酸，蛋口相对分子质量5602kDa,理论等电点889；经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后，TwKAO基
2、因相对表达量在12h达到峰值;经植株组织表达分析证实，TwKAO基因在雷公藤的叶中表达量最高，根中最低。该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因，并分析其mRNA表达特征，为深入研究雷公藤生长发育以及祜类活性成分次生代谢研究奠定基础。［关键词］雷公藤；贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)；克隆；生物信息学分析；表达分析药用植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHookf系卫矛科木质藤本植物，临床中多使用其根或根的木质部入药，具有抗炎、神经保护、免疫调节、抗肿瘤等活性，可用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等免疫疾病
3、。近年来发现，雷公藤中重要的二菇类成分雷公藤甲素在抗肿瘤尤其是治疗胰腺癌［12］方面具有显著疗效。由于其广泛的药理活性，对雷公藤有效成分药理作用、生物合成等方面的研究得到越来越多的关注［35］。赤霉素是植物牛长发育中必不可少的激素，参与植物牛长包括种子萌发，茎伸长以及开花等过程。而赤霉素的生物合成过程中，从ent贝壳杉烯、ent贝壳杉醇、ent贝壳杉醛到ent贝壳杉酸，再到ent7过羟基贝壳杉烯酸等连续反应都是由CYP450催化而成［6］。贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoicacidoxidase,KAO)参与从贝
4、壳杉烯酸到GA12的反应过程［7］,其属于细胞色素P450中CYP88A亚家族，参与赤霉素牛物合成途径中3步连续的催化反应［8］。目前，KAO基因己从小麦［910］,豌豆［11］,梨［12］等植物中克隆得到，并研究其缺失对向FI葵矮小突变体的影响［13］。雷公藤屮KAO基因尚未克隆得到，因此本研究以雷公藤悬浮细胞为研究材料，克隆得到长度为1874bp的TwKAO基因，研究其在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后240h内基因的表达水平，并进行生物信息学分析，为进一步研究雷公藤重要活性成分生物合成提供宝贵的基因资源。1材料1
5、1植物雷公藤悬浮细胞由首都医科大学中药资源与分子生药学实验室继代保存。培养条件:05mg?L-l2,4D+01mg?L~lKT+05mg?L-lIBA+MS液体培养基，25°C,120r?min-l避光培养。12菌株及载体EscherichiacoliTrans5a感受态细胞、pEASYT3vector购自北京全式金生物技术有限公司。13仪器与试剂VeritiTM96孔梯度PCR仪，TF7500型RealTimePCRSystem为美国AppliedBiosystoms公司，318k型高速冷冻离心机为SIGMA公司
6、；PhusionHighFidelityPCRMasterMixwithHFBuffer?自美国NEB公司；FastQuantRTKit(WithgDNaso)＞琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，EastepSuper总RNA提取试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序服务由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。2方法21RNA提取与纯化使用CTAB法提取雷公藤悬浮细胞总RNA并依据RNA纯化试剂盒说明书
7、进行纯化，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。22全长cDNA克隆与测序使用FastQuantRTKit将雷公藤悬浮细胞总RNA反转录成cDNA,根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计全长特异性引物24TwKA0基因的诱导表达分析于雷公藤悬浮细胞继代培养12d后，使用茉莉酸甲酯(50nmol?L-l)诱导，设置对照组。于诱导后不同时间点(0,12,24,48,72,240h)取样，每个吋间点设置4个平行样品。使用EFLa基因作为内参基因，根据所得TwKAO序列设计实时荧光定量特异性引物。提収雷公藤悬浮细胞总RNA并反转
8、录成cDNA,进行TwKAO基因的诱导表达分析。实时荧光定量反应体系:10UL2XSYBRgreenMix,04uLROXHigh.正反引物(10umol?L-l)各04uL,78uLddH20和1uLcDNAo反应程序：95°C3min；95°C3s,60°C30s,40个循环。每个反应重复3次，用2-AACt法分析其mRNA相对表达水平。25TwKA0基
