三角帆蚌钙代谢相关基因的全长cdna克隆与表达分析

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1、2．3．3钙网蛋白氨基酸序列同源性分析和进化树构建⋯，．．．．⋯192．3．4钙网蛋白基因的表达特征．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．232．4讨论⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯⋯．．．．．．．．⋯．253三角帆蚌肌球蛋白必需轻链基因eDNA的全长克隆与表达分析⋯．．．．．．283．1试验材料．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．⋯．．⋯．．．．．．．．283．1．2主要试剂．．．．．．．．．．．⋯．⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．．．．283．1．3主要仪器设备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

2、．．．．．．283．1．4主要试剂配制．．．．．．．．．⋯⋯．．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．283．2试验方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．。．．．．．．283．2．1RNA的提取．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．283．2．2RT—PCR．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．⋯⋯⋯283．2．3PCR扩增MELC基因部分序列．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．283．2．4目的片段割胶回收．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．293．2．

3、5DNA片段与T载体连接．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．⋯．．．．．．．．293．2．6连接产物转化大肠杆菌感受态细胞⋯．．．．．．．⋯．．．．．．．．293．2．7菌落PCR鉴定阳性克隆⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．293．2．8SMARTcDNA的合成⋯．．．．⋯．．⋯⋯⋯．．．．．．．⋯．．．．293．2．9RACE-PCR扩增得到MF,LC基因的全长eDNA序列．⋯⋯．⋯293．2．10序列分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．⋯⋯．．．．．．．．．303．2．11实时荧光定量PCR⋯．．⋯．．．．．．．．⋯⋯⋯⋯．．．．⋯3l3．3结果与分

4、析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．313．3．1MELC基因全长扩增和序列分析⋯．．．．．⋯．．．⋯．．．．⋯．313．3．2MELC氨基酸序列组成和结构特征．．．．⋯⋯．．．．．．．⋯⋯343．3．3MELC氨基酸序列同源性分析和进化树构建．．⋯⋯．．．．⋯343．3．4gELC基因的表达分析．．⋯．⋯⋯．．．．．⋯⋯⋯⋯．．．．383．4讨论．．．．⋯．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．404小结．．．．．．．．．⋯．．．．⋯⋯．．．⋯．．．．．．．⋯⋯．．．．⋯．．．．．．．．．42参考文

5、献．．．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯⋯⋯⋯．．．⋯．．⋯⋯．．．．⋯．．．44已发表及录用的相关论文．．⋯．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．⋯⋯．．⋯⋯．．50致谢⋯．．．．．．．．．⋯⋯．．⋯．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．⋯⋯⋯．．⋯51浙江大学硕士学位论文摘要三角帆蚌钙代谢相关基因的全长eDNA克隆与表达分析摘要珍珠是贝类进行钙代谢的主要产物，其中95％以上的成份是CaC03晶体。三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我国特有的优良淡水育珠蚌，其生长速度快、育珠质量好。本试验以三角帆蚌外套膜为研究材料，采用同源克隆策略和RACE技术，成功克隆得到钙网蛋白基因(calr

6、eticulin，CRT)、肌球蛋白必需轻链基因(myosinessentiallightchain，MELC)的全长cDNA序列，并对其核苷酸序列和氨基酸序列结构进行分析，然后对上述两个基因在不同组织和不同Ca2+浓度处理下外套膜中的表达情况进行了研究，探讨了CRT基因、MELC基因与Ca2+吸收、转运与贮存等关系，并推测其参与三角帆蚌钙代谢的过程，试验结果如下：采用同源克隆策略和RACE技术，从三角帆蚌外套膜组织中成功克隆得到CRT基因和MELC基因的全长cDNA序列：(1)CRT基因全长1838bp，其中开放阅读框为1257bp，编码418个氨基酸，相对分子量为49．10kIl，理

7、论等电点为4．46，5’端非编码区为75bp，3’端非编码区为506bp，GenBank登录号为JX416227；(2)MELC基因全长1119bp，开放阅读框为468bp，编码155个氨基酸，相对分子量为17．49ku，理论等电点为4．53，5’端非编码区为46bp，3’端非编码区为605bp，GenBank登录号为JX275828。生物信息学分析表明：(1)三角帆蚌CRT基因具有一段信号肽序列、两条典型的钙网蛋白家族标签序列KH