三角帆蚌贝壳珍珠层颜色形成相关基因的克隆与表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M120107184上海海洋大学硕士学位论文三角帆蚌贝壳珍珠层颜色形成相关基因的克隆与表题目：达分析CloningandExpressionAnalysisofGenesInvolved英文题目：intheNacreColorofShellinHyriopsiscumingii专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：水产动物种质资源与种苗工程姓名：罗红瑞指导教师：李家乐教授二O一五年六月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外

2、，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上

3、海海洋大学博士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注王群华东师范大学教授主席汪桂玲上海海洋大学副教授委员白志毅上海海洋大学副教授委员牛东红上海海洋大学副教授秘书答辩地点水产与生命学院C217答辩日期2015.06.04上海海洋大学硕士学位论文三角帆蚌贝壳珍珠层颜色形成相关基因的克隆与表达分析摘要三角帆蚌是我国特有的优良淡水育珠蚌。颜色是评价珍珠质量的重要指标。供片贝贝壳珍珠层颜色(贝壳内壳色)显著影响珍珠颜色。本研究从珍珠或贝壳珍珠层呈色的直接因素（金属离子、有机物和珍珠层结构）着手，以实验室构建的紫色家系三角帆蚌（贝壳珍珠层颜色为紫色）和白色家系三角帆蚌（贝壳珍珠层颜色为白色

4、）为实验材料，从紫色家系和白色家系三角帆蚌外套膜和珍珠囊比较转录组文库中筛选得到4个三角帆蚌贝壳珍珠层颜色形成相关基因。1．三角帆蚌HcGIFLP基因的克隆与表达分析克隆得到三角帆蚌两个胃内因子样蛋白（gastricintrinsicfactor-likeprotein，GIFLP）基因（HcGIFLP1和HcGIFLP2），并进行荧光定量、原位杂交及原核表达实验。HcGIFLP1基因cDNA全长619bp，编码140个氨基酸；HcGIFLP2基因cDNA全长821bp，编码148个氨基酸，GenBank登录号分别为KR822703和KR822704。HcGIFLP1和HcGIFLP2

5、基因编码的多肽N端均含有一段由23个氨基酸组成的信号肽，无跨膜结构域，核苷酸序列和氨基酸序列相似度均较高。荧光定量结果显示，HcGIFLP1基因主要在肝胰腺中表达，并且在紫色蚌中的表达量极显著高于白色蚌（P<0.01）。HcGIFLP2基因主要在外套膜中表达，在紫色蚌后端缘膜中的表达量极显著高于I上海海洋大学硕士学位论文白色蚌（P<0.01）。原位杂交结果显示，HcGIFLP1和HcGIFLP2基因在外套膜中的表达部位基本相同，杂交信号主要出现在外套膜缘膜的外上皮细胞，边缘膜中褶的外上皮细胞中也有一些信号。原核表达结果显示，两个基因的重组蛋白均主要以包涵体的形式存在。根据两个基因的氨基

6、酸序列设计多肽制备多克隆抗体，并用原核表达纯化蛋白检测抗体的特异性，结果显示HcGIFLP1蛋白的抗体特异性较好，只能检测到自身的重组蛋白，HcGIFLP2蛋白的抗体未能检测到自身及HcGIFLP1的重组蛋白。2．三角帆蚌HcCUBDC基因的克隆与表达分析克隆得到三角帆蚌一个CUB结构域包含蛋白（CUBdomaincontainingprotein，CUBDC）基因HcCUBDC，并进行荧光定量和原位杂交检测分析。HcCUBDC基因cDNA全长5158bp，编码639个氨基酸，GenBank登录号为KP067952。HcCUBDC蛋白含有4个CUB结构域，属于CUB超家族，N端含有一段

7、由19个氨基酸组成的信号肽，无跨膜结构域。荧光定量结果显示，HcCUBDC基因在各个组织中均有表达，其中肝胰腺中表达量最低。在紫色蚌中，后端缘膜表达量极显著高于前端缘膜（P<0.01）；在白色蚌中，前端和后端缘膜之间表达差异不显著。HcCUBDC基因在紫色蚌后端缘膜中表达量极显著高于白色蚌（P<0.01），在紫色和白色蚌前端缘膜中表达差异不显著。外套膜原位杂交结果显示，HcCUBDC基因主要在外套膜缘膜外上皮细胞中表达。3．三角帆蚌HcCA2基