三角帆蚌抗菌肽基因的克隆和表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M090107275上海海洋大学硕士学位论文题目：三角帆蚌抗菌肽基因的克隆和表达分析CloningandExpressionanalysisoftwoantimicrobial英文题目：peptidegenesfromHyriopsiscumingii专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：水产动物种质资源与种苗工程姓名：董姝君指导教师：汪桂玲副教授李家乐教授二O一二年五月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立

2、进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书[1]学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手

3、段保存和汇编本学位论文。保密□,在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期上海海洋大学硕士学位论文三角帆蚌抗菌肽基因的克隆和表达分析摘要以三角帆蚌（Hyriopsiscumingii）为研究材料，根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列,利用RACE法克隆得到两个三角帆蚌抗菌肽基因（theromacin、bigdefensin）的cDNA全序列，并对这2个基因的

4、cDNA序列及推测得到的氨基酸序列特征进行分析。利用实验室克隆得到的三角帆蚌β-肌动蛋白（β-actin）基因作为内标，半定量PCR分别检测2个基因在三角帆蚌外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足8个组织的表达差异，并通过嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophilia）感染，研究这2个基因在外套膜、血液、肝脏、肠、鳃和斧足6个组织在感染后不同时间点进行实时荧光定量PCR的表达情况究。通过构建2个抗菌肽基因的原核表达载体并用IPTG作为诱导剂诱导两个基因的重组质粒在表达菌株E.coliBL21(DE3)中表达

5、，SDS-PAGE进行初步分析。主要研究结果如下：1)三角帆蚌theromacin基因的克隆和分子结构分析该cDNA序列全长为970bp，5‘端非翻译区123bp，3‘端非翻译区526bp，开放阅读框（ORF）长为300bp，共编码99个氨基酸，包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽，分子量为10924.7u。氨基酸序列分析表明，该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明，该基因编码的蛋白与海兔（Aplysiacalifornica）theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%，而与贻

6、贝等中发现的抗菌肽（defensins、mytilins、myticins和mytimycins）相似度较低。将所得的氨基酸序列与其他物种的不同抗菌肽的氨基酸序列进行多重序列比对，构建系统树，结果显示，本实验克隆所得三角帆蚌theromacin与已发表的几种无脊椎动物抗菌肽相聚，而不与两种贻贝的抗菌肽聚集在一起，推测此基因与这两种贻贝中发现的抗菌肽不属于同一种类型。Jpred3软件对三角帆蚌theromacin蛋白的二级结构预测结果表明，在第2-22、57-62氨基酸残基处存在α螺旋，因此，三角帆蚌的theroma

7、cin蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。以水螅（Hydramagnipapillata）Hydramacin-1A链三级结构为模板，通过ESyPred3D预测三角帆蚌theromacin蛋白的三级结构显示，此蛋白与水螅的Hydramacin-1三级结构相似。I上海海洋大学硕士学位论文2)三角帆蚌bigdefensin基因的克隆和分子结构分析该cDNA序列全长为604bp，末端有典型的多聚腺苷酸信号序列AATAA和ploy（A）尾，5‘端非翻译区166bp，3‘端非翻译区96bp，开放阅读框（ORF）长为342bp，共编码

8、113个氨基酸，包含一段由23个氨基酸组成的信号肽和90个氨基酸的成熟肽，分子量为12554.6u。氨基酸序列分析表明，该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析显示，该基因编码的蛋白与文昌鱼（Branchiostomafloridae）bigdefensin氨基酸序列的相似度最高为64%，而与已知的防御素（α-、β-、θ-防御素和昆虫防御素）相似度较低。