三角帆蚌几丁质代谢酶基因的克隆表达和功能分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M090107269上海海洋大学硕士学位论文三角帆蚌几丁质代谢酶基因的克隆表达和题目：功能分析ChitinmetabolicenzymegenesfromHyriopsis英文题目：cumingii:cloning,characterizationandpotentialfunctions专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：水产动物种质资源与种苗工程姓名：徐波指导教师：汪桂玲副教授李家乐教授二O一二年三月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明

2、确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书[1]学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日

3、期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期上海海洋大学硕士学位论文三角帆蚌几丁质代谢酶基因的克隆表达和功能分析摘要三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我国最重要的淡水育珠母蚌。本实验克隆了三角帆蚌几丁质酶-3和甲壳素脱乙酰酶两个几丁质代谢酶基因，并通过组织特异性表达、破壳诱导表达和原核表达推测两个基因的可能生理功能；采用两种方法，磁珠富集法和5’锚定PCR法构建背瘤丽蚌微卫星文库开发的SSR标记，并将开发的部分引物用于三角帆蚌进行扩增以检查引物的扩增效果及通用性。主要研究结果如下：1．三角帆蚌2个几丁质代谢基因cDNA

4、全序列的克隆及分子特征三角帆蚌几丁质酶-3（Chi-3）基因的cDNA序列全长2523bp，包括196bp的5′端非翻译区（UTR），1962bp的开放阅读框，可编码653个氨基酸残基，365bp的3′端非翻译区(UTR)。和其它已知几丁质酶相似，Chi-3含有一个信号肽和3个保守结构域：1个GH18糖水解结构域和2个几丁质结合区CBM14。BLAST分析后表明该基因的氨基酸序列与其它已知生物的同种基因氨基酸序列相似度为21.3–34.4%，而与其它五个物种的相似度略高，为27.2–34.7%。进化树显示三角帆蚌几丁质酶-3与太平洋牡蛎的几丁质酶-3聚成一支，说明三角帆蚌几丁质酶-3属于

5、双壳类几丁质酶-3家族。三角帆蚌甲克素脱乙酰酶（Cda）基因的cDNA全长2654bp，包括347bp的5′端非翻译区(UTR)，1938bp的开放阅读框，可编码645个氨基酸残基,369bp的3′端非翻译区(UTR)。分子进化树显示三角帆蚌甲壳素脱乙酰酶与棉铃虫、蓓带夜蛾、甘蓝夜蛾聚为在第四组。这个组的甲壳素脱乙酰酶基因仅含有一个信号肽序列和一个多聚糖脱乙酰结构域。2．三角帆蚌2个几丁质代谢基因表达分析及功能研究三角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因组织特异性表达。以β-actin基因为内参，结果显示几丁质酶-3基因在除血液以外的其它7个组织均有表达，其中在外套膜、肝、胃、肾中表

6、达相对较高，而在肠、鳃、斧足中表达量相对较低；甲壳素脱乙酰酶基因在8个组织均有表达，其中在外套膜、胃、斧I上海海洋大学硕士学位论文足中表达相对较高，而在血液、肝、肾、肠、鳃、中表达量相对较低。三角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因破壳诱导表达。三角帆蚌外套膜中几丁质酶-3基因的表达量在破壳后的12小时显著增加（p>0.05），而随后逐渐降低到正常水平；甲壳素脱乙酰酶基因的表达量在破壳后无显著增加（p>0.05）。三角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因原核表达。三角帆蚌几丁质酶-3基因的原核表达以IPTG终浓度1mmol/L，24℃为最佳诱导表达条件，SDS-PAGE电泳检测图

7、谱显示，1-4h重组蛋白的表达量呈明显上升的趋势，4-8h重组蛋白表达量增速减缓。本实验选用pGEX-5X-1载体，其表达产物为融合蛋白，含有一个26KD的GST标签和大小为约10KD的几丁质酶-3结构域，融合蛋白大小为36KD；甲克素脱乙酰酶基因的原核表达以IPTG终浓度1mmol/L，37℃为最佳诱导表达条件，SDS-PAGE电泳检测图谱显示，1-8h重组蛋白的表达量呈上升的趋势。其表达产物融合蛋白含有一个26KD的GST标签和