黄绿木霉和球孢白僵菌几丁质降解酶基因的克隆与表达

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1、摘要几丁质降解酶是一组能降解几丁质，生成几丁低聚糖的酶的总称。几丁质是由B—l，4糖昔键连接的N．乙酰氨基葡萄糖的多聚物，是储量仅次于纤维素的第二大生物资源。化学方法制各几丁质及其衍生物由于产生二次污染已经逐渐被酶法取代，但由于几丁质降解酶传统发酵生产的成本高又不容易获得单一酶组分，使得酶法难于推广，因此生产廉价的几丁质降解酶成为解决这一问题的症结。本研究通过基因工程的方法克隆几丁质降解酶基因，转入酿酒酵母中，为大量生产几丁质降解酶奠定基础。黄绿木霉(Trichodermaaureoviride)和球孢白僵菌(Beauveriabas

2、siana)是自然界普遍存在的真菌，具有高效的几丁质降解酶体系。本论文以黄绿木霉(zaureoviride)和球孢白僵菌(B．bassiana)为出发菌株：采用PCR方法克隆到黄绿木霉(zaureoviride)和球孢白僵菌(B．bassiana)几丁质降解酶基因eeh42、chitl、chit2和cnslDNA片段，测序后将这些基因DNA片段构建到酿酒酵母(&cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上，转化获得的转化子经诱导，用Northern杂交验证了目的基因的转录表达。采用DNS法．分别以胶态几丁质为底物，研究了各个转化子

3、的酶活性、培养周期，重组酶的最适温度和pH值，以及重组酶的协同作用。本论文从黄绿木霉(raureoviride)和球孢白僵菌(B．bassiana)菌株的DNA中，通过引物设计，用PCR方法克隆得到了ech42、chitl、chit2、cnsl的DNA片段，共4个基因片段。对其中的DNA片段进行测序，证实得到了全部是几丁质降解酶基因的DNA片段。采源于黄绿木霉的几丁质酶基因ech42序列递交国际权威基因数据库GenBank，经审核确认没有与数据库中重复的序列后，将该序列在数据库上发表，序列号为AY850032。添补了国际权威基因数据库

4、GenBank在黄绿木霉几丁质酶基因这一内容上的空白。将克隆到的4个目的基因构建到带有高效启动子的酿酒酵母表达载体pYES2上，得到4个重组质粒。用酿酒酵母完整细胞转化法将以上4个重组质粒转入酿酒酵母(scerevisiae)H158细胞中，通过酿酒酵母菌落PCR和双酶切鉴定证实了转化的成功，得到了带有4种几丁质降解酶基因DNA片段的酿酒酵母(Scerevisiae)H158转化子。对转化子的Northern杂交检测分别得到了与预期大小相符的杂交信号哈尔滨工业大学工学博士学位论文带，证实了各个几丁质降解酶基因DNA片段在GALl启动子

5、控制下经半乳糖诱导在酿酒酵母(scerev括iae)中成功转录表达；并通过DNS法研究了各个转化子的发酵周期，发现ech42、chitl、chit2和cnsl转化子产酶高峰的出现时间分别为36h、48h、36h和48h(接种量为5mL)，各转化子酶活的最大值分别为0．50、0．47、0．63、和0．62UmL～；各重组酶的最适反应温度分别为Ech4240℃、Chitl70℃、Chit270℃、Cnsl70℃；各重组酶的最适pH值分别为Ech428．0、ChRl8．0、Chit25．0、Cnsl4．6。比较了在相同条件下4种转化子分泌的

6、重组酶的协同作用，结果表明在相同条件下4种重组酶不同组合的酶活差异十分显著。在所有的组合当中，Cnsl和chitl组合的酶活最高0．75UmL～，Chitl和Chit2组合酶活最低0．21UmL一。重组酶Ech42和Cnsl与其它重组酶之间存在正协同效应，Chitl和Chit2之间是负协同效应。黄绿木霉(Zaureoviride)和球孢白僵菌(Bbassiana)的几丁质降解酶基因DNA片段的克隆，为进一步研究几丁质降解酶基因在酿酒酵母(Scerevisiae)等其他细胞中的表达及重组酶的特性提供了重要的材料：为其他有关抗病抗虫基因工

7、程提供了重要基因资源。通过对转化子的发酵周期和重组酶的酶学特性分析证实了酿酒酵母(Scerevisiae)可以正确表达黄绿木霉(Taureoviride)和球孢自僵菌(B．bassiana)的几丁质降解酶基因的DNA片段，为构建可大量生产几丁质降解酶的酵母工程菌提供了重要理论依据。实验中四种几丁质降解酶存在不同的协同作用的结果，为进一步研究其他不同的几丁质降解酶组合的协同作用提供了新的思路，对进一步研究，L丁质降解酶的实际应用具有重要的意义。关键词黄绿木霉；球孢白僵菌；几丁质降解酶基因；酿酒酵母；克隆与表达AbstractChitin

8、olyticenzymesareaheterogeneousgroupofenzymesthatcatalysethehydrolyticdepolymerisationofchitin，whichislongchain