扁豆几丁质酶基因的克隆及表达-论文.pdf

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1、第4()卷第4期福州大学学报(自然科学版)Vo1．40No．42012年8月JournalofFuzhouUniversity(NaturalScienceEditionAaft[．2012URL：http：／／www．cnk1．net／kcms／detail／35．1117．N．20120628．1434．009．html文章编号：1000—2243(2012)04—0551—06扁豆几丁质酶基因的克隆及表达陈增，叶秀云，李仁宽，冯爱华。，林娟，杨捷(1．福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108；

2、2．福州大学酶高效表达国家工程实验室，福建福州350002)摘要：以扁豆总RNA为模板，通过RT—PCR技术扩增到长度为885bp的扁豆几丁质酶基因eDNA，其编码294个氨基酸，目的蛋白的分子量为28．429kDa．以该基因构建pET一21a—chi表达载体并在EcoliBL21(DE3)中表达．30℃下，用0．1mmol·L～IPTG，诱导5h，表达产物的酶活力为36．25U·mL～．通过常压SephadexG一50凝胶过滤色谱，DEAE一650C常压与高效离子交换色谱对表达产物进行纯化．目标蛋白达到电

3、泳纯(SDS电泳一条带)，几丁质酶的比活力108．42U·mg～．表达的蛋白质产物主要以可溶性形式存在．关键词：扁豆；几丁质酶基因；克隆；表达；纯化中图分类号：Q784文献标识码：ACloningandexpressionofachitinasegenefromdolichoslablabCHENZeng，YEXiu—yun一，LIRen—kuan一，FENGAi—hua，LINJuan，YANGJie，(1．CollegeofBiologicalSciencesandTechnology，FuzhouUn

4、iversity，Fuzhou，Fujian350108，China；2．NationalEngineeringLaboratoryforHighlyEficientEnzymeExpression，FuzhouUniversity，Fuzhou，Fujian350002，China)Abstract：ThechitinasegenecDNAwasamplifiedbyRT—PCRwithtotalRNAextractedfromdolichoslablabasthetemplate．Thelengthof

5、cDNAWas885bp．whichencoded294aminoacidswitl1thepre—dietedmolecularweightof28．429kDa．ThegeneWasusedtoconstructt}leplasmidofpET一21a—chiandexpressedinEcoilBL21(DE3)strain．At30oC．afterinductionfor5hwith0．1mmol·L-1Im．theintracelhlarchitinaseactivityof36．25U·mLI1

6、wasreachedintherecombinantstrain．eexpressedproductwaspurifiedbygelfiltrationchromatographyonSephadexG一5Oandhighper-formanceionexchangechromatographyonDEAE一650C．epurifiedtargetedproteinappearedasasinglebandonSDS—PAGE．andthespecificenzymeactivitywas108．2U·mg

7、_。．nleplant—de—rivedchitinasegeneCallbeexpressedstablyinE．coliBL21(DE3inthesolubleform．Keywords：dolichoslablab；chitinase；cloning；expression；purification0弓I言几丁质酶(EC3．2．1．14)是一种分解几丁质(1，4一N一乙酰一p—D一氨基葡萄糖，N—actylglu—cosamine，NAG)的糖苷酶，主要水解几丁质多聚体中的糖苷键⋯，生成乙酰氨基葡萄糖寡

8、体和单体】．几丁质酶广泛存在于各种微生物、植物及动物细胞中．其中植物几丁质酶的功能十分广泛，常被用于植物病原菌和害虫的生物防治J．目前已知被克隆的植物几丁质酶基因大约有250—300个，但这些基因的同源性并不是很高，即没有相对高度保守的核苷酸序列，这使得对植物来源的几丁质酶基因进行克隆时存在诸多困难，因而造成植物基因工程中可利用的几丁质酶基因较稀少一’】．当前常通过基因工程技术将几丁质酶基因导人植物中表达，以期获