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《扁豆几丁质酶基因的克隆及表达-论文.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第4()卷第4期福州大学学报(自然科学版)Vo1.40No.42012年8月JournalofFuzhouUniversity(NaturalScienceEditionAaft[.2012URL:http://www.cnk1.net/kcms/detail/35.1117.N.20120628.1434.009.html文章编号:1000—2243(2012)04—0551—06扁豆几丁质酶基因的克隆及表达陈增,叶秀云,李仁宽,冯爱华。,林娟,杨捷(1.福州大学生物科学与工程学院,福建福州350108;
2、2.福州大学酶高效表达国家工程实验室,福建福州350002)摘要:以扁豆总RNA为模板,通过RT—PCR技术扩增到长度为885bp的扁豆几丁质酶基因eDNA,其编码294个氨基酸,目的蛋白的分子量为28.429kDa.以该基因构建pET一21a—chi表达载体并在EcoliBL21(DE3)中表达.30℃下,用0.1mmol·L~IPTG,诱导5h,表达产物的酶活力为36.25U·mL~.通过常压SephadexG一50凝胶过滤色谱,DEAE一650C常压与高效离子交换色谱对表达产物进行纯化.目标蛋白达到电
3、泳纯(SDS电泳一条带),几丁质酶的比活力108.42U·mg~.表达的蛋白质产物主要以可溶性形式存在.关键词:扁豆;几丁质酶基因;克隆;表达;纯化中图分类号:Q784文献标识码:ACloningandexpressionofachitinasegenefromdolichoslablabCHENZeng,YEXiu—yun一,LIRen—kuan一,FENGAi—hua,LINJuan,YANGJie,(1.CollegeofBiologicalSciencesandTechnology,FuzhouUn
4、iversity,Fuzhou,Fujian350108,China;2.NationalEngineeringLaboratoryforHighlyEficientEnzymeExpression,FuzhouUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)Abstract:ThechitinasegenecDNAwasamplifiedbyRT—PCRwithtotalRNAextractedfromdolichoslablabasthetemplate.Thelengthof
5、cDNAWas885bp.whichencoded294aminoacidswitl1thepre—dietedmolecularweightof28.429kDa.ThegeneWasusedtoconstructt}leplasmidofpET一21a—chiandexpressedinEcoilBL21(DE3)strain.At30oC.afterinductionfor5hwith0.1mmol·L-1Im.theintracelhlarchitinaseactivityof36.25U·mLI1
6、wasreachedintherecombinantstrain.eexpressedproductwaspurifiedbygelfiltrationchromatographyonSephadexG一5Oandhighper-formanceionexchangechromatographyonDEAE一650C.epurifiedtargetedproteinappearedasasinglebandonSDS—PAGE.andthespecificenzymeactivitywas108.2U·mg
7、_。.nleplant—de—rivedchitinasegeneCallbeexpressedstablyinE.coliBL21(DE3inthesolubleform.Keywords:dolichoslablab;chitinase;cloning;expression;purification0弓I言几丁质酶(EC3.2.1.14)是一种分解几丁质(1,4一N一乙酰一p—D一氨基葡萄糖,N—actylglu—cosamine,NAG)的糖苷酶,主要水解几丁质多聚体中的糖苷键⋯,生成乙酰氨基葡萄糖寡
8、体和单体】.几丁质酶广泛存在于各种微生物、植物及动物细胞中.其中植物几丁质酶的功能十分广泛,常被用于植物病原菌和害虫的生物防治J.目前已知被克隆的植物几丁质酶基因大约有250—300个,但这些基因的同源性并不是很高,即没有相对高度保守的核苷酸序列,这使得对植物来源的几丁质酶基因进行克隆时存在诸多困难,因而造成植物基因工程中可利用的几丁质酶基因较稀少一’】.当前常通过基因工程技术将几丁质酶基因导人植物中表达,以期获
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