棘孢木霉菌几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质分析.pdf

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1、万方数据Cloning，ExpressionandEnzymeCharacterizationAnalysisofChitinaseGenefromTrichodermaasperellumThesissubmittedtoO物daoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequire：mentfortheDegreeofMasterofScienceCongDaPeng(CollegeofLifeScience)Supervisor：XianHongquanQing

2、dao．ChinaJune，2012万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研壳生签名：左盔火砷乌时间：工侈7游莎月；阳关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复

3、印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)时间：>。，L年多月多勺日时间：沙7L年易月雩伊阻略靶久限终成名签生币修导万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要木霉菌作为一种生防菌，在生物防治中占有极其重要的地位，在其重寄生过程中产生的几丁质酶能够降解多种病原菌细胞壁。几丁质酶普遍存在于各种动物、植物和微生物中，在医药、食品、环保、生防等许多领域显示出广阔的

4、应用前景。国内外已经筛选出多种几丁质酶产生茵，并将其进行分离纯化。但只有部分在实际中得到应用，主要原因是菌株的产酶能力较低。因此克隆几丁质酶基因、实现其高效表达是解决问题的一条重要途径。本文根据几丁质酶基因序列保守区设计简并引物、再根据克隆到的几丁质酶基因片段序列设计特异性引物，运用RT．PCR、RACE．PCR、TAIL．PCR技术，从木霉菌Td3104中克隆出完整的几丁质酶基因tachi2。全长DNA序列为1447br,，阅读框架(ORF)位于31～1364位核苷酸之间，包含2段内含子序列，编码397个氨

5、基酸。该基因DNA序列已提交GenBank，登录号为JF309106。利用DNAMAN软件对木霉菌Td3104几丁质酶的分子量、等电点、疏水性和亲水性等性质进行了分析，同时还预测了其二级结构，结果显示该蛋白的分子量为44．482kDa，等电点为5．67。分别将几丁质酶基因tachil和tachi2与原核表达载体pEHisTEV融合，构建了表达载体pEHisTEV／tachil和pEHisTEV／tachi2，将重组表达质粒pEHisTEV／tachil和pEHisTEV／tachi2分别转化BL21感受态细胞

6、，经过PCR检测及筛选，转化子进行IPTG诱导培养，获得了以包涵体形式高效表达的Tachil和Tachi2。包涵体经洗涤、溶解、复性和纯化后获得了高纯度的Tachil和Tachi2。复性后的Tachil和Tachi2具有较高的几丁质酶活性，收集几丁质酶蛋白，进行SDS．PAGE电泳，得出重组蛋白Tachil和Tachi2的分子量都约为44kDa。几丁质酶Tachil最适反应温度是35℃，最适反应pH值为6．0。Tachil凡丁质酶的稳定性测定结果表明，酶液在30℃以下温度处理1h，酶性质稳定；在pH5-9条件

7、下处理1h，活性变化不明显。K+金属离子对酶活力有明显的激活作用，而Zn2+、Cu2+、M92+等对该酶有明显的抑制作用。几丁质酶Tachi2的最适温度为40。C，最适pH值为7．0，在pH6．8时酶活性质较稳定；Mn2+、Fe2+对表达几丁质酶有激活作用，其中Mn2+的激活作用最明显，Fe2+次之；Cu2+、Zn2+等对表达几丁质酶有显著的抑制作用；而K+、Nr对酶活性影响不大。关键词：棘孢木霉；几丁质酶；基因克隆；表达；纯化；复性；酶学性质万方数据青岛农业大学硕士学位论文AbstractTrichoder

8、maisanimportantbiocontrolfungztswhichproducesvariouschitinasetOdegradethecellwallofthefungalpathogensintheprocessofhyperparasitization．Chitinaseexistinallkindsofanimals，plantsandmicroorganismsgenerally