新型低温蛋白酶基因的克隆表达及酶学性质研究

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1、万方数据分类号：Q815密级：(秘密、机密、绝密)学校代码：10057研究生学号：11812508新型低温蛋白酶基因的克隆表达及酶学性质研究Genecloning，expressionandcharacterizationofnovelcold-adaptedproteases专业名称：指导教师姓名：研究生姓名：申请学位级别：论文提交日期：论文课题来源：学位授予单位：微生物与生化药学(理)路福平教授莫清珊理学硕士2014年5月自选天津科技大学万方数据天津科技大学学位论文原创性声明晰Y惝2m7㈣5㈣5㈣10m3矾本人

2、郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果内容，也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对采文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：翩埘日期：Ⅻf牛年乡月日知识产权和专利权保护声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位

3、属天津科技大学；所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为天津科技大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：珈f缸年舌月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，同意公布论文的全部或部分内容，允许论文被查阅和借阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、

4、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密ll(请在方框内打“√”)，在年解密后适用本授权书。作者导师年月日年月曰万方数据摘要低温蛋白酶是指最适催化温度在40℃以下的一类蛋白水解酶，一般由嗜低温微生物或耐低温微生物产生。由于其最适催化温度接近自然环境中的温度，因此在应用过程中可省去加热和冷却过程，与中高温蛋白酶相比具有节能、省时等特点。本研究旨在从嗜低温微生物中筛选新型低温蛋白酶，研究分析其酶学性质，并对编码基因进行克隆与表达方面的研究。具体研究工作包括如下4个方面：(1)从南印度洋的深海沉积物中分离到一株嗜低

5、温动性球菌(Planococcussp．11815)，该菌株可以在0．4℃之间进行正常的生长代谢，并在20℃以下具有表达分泌低温蛋白酶的能力，经48h摇瓶发酵，蛋白酶产量可达280U／mL。酶学性质分析结果显示：该菌株所产蛋白酶的最适作用pH值为8．0，最适作用温度为37℃，当催化温度降至30℃时，酶活可保持在80％以上，并且在4℃条件下仍具有水解蛋白的能力。因此该菌株所产蛋白酶属于典型的低温碱性蛋白酶，具有一定的研究及开发价值。(2)通过设计简并性引物并采用反向PCR的方式从筛选获得的嗜低温动性球菌中分别克隆到两

6、种蛋白酶编码基因：cpls8和cpls41，序列分析结果显示：cpls8所编码的蛋白属于丝氨酸蛋白酶中的S8家族，是一种胞内蛋白酶；而cpls41所编码蛋白属于$41家族，是一种分泌型蛋白酶。Blast比对结果显示：cpls8与cpls41基因所编码蛋白与目前数据库中已发表的蛋白酶序列的最高同源性分别为72％和76％，因此可确定为新型编码基因。(3)将cpls8基因克隆至表达型载体pET-22b上，并在大肠杆菌Rosseta(DE3)中实现了功能表达。重组蛋白酶CPLS8经分离纯化后，比酶活可达到32．68U／mg

7、，其最适作用温度为37℃，最适pH为10．0，在45℃保温60min，则酶活完全丧失。Ca+对该酶起促进作用，而EDTA等离子鳌合剂以及PMSF则对该酶有抑制作用。(4)将cpls41的编码基因分别克隆至融合表达载体pET-32a上，在E．coliRossetaDE3中实现了CPLS41的融合表达。经蛋白分离纯化、肠激酶处理去除融合蛋白后，CPLS41极不稳定，完全降解；进一步尝试将该基因在枯草芽孢杆菌WB600中进行分泌表达，未获成功。关键词：动性球菌；低温蛋白酶；重组酶；异源表达；酶学特性万方数据ABSTRAC

8、TThecold．adaptedproteasesarecharacterizedbylowoptimalcatalytictemperatures(below40。C)，whichweregenerallyproducedbypsychrophilicorpsychrotolerantmicroorgnisms．Basedontheirhighcataly