刺参丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的克隆、表达及性质分析

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1、学校编码10390分类号Q78学号201211710025密级硕士学位论文剌参丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的克隆、表达及性质分析指导教师：曹敏杰教授作者姓名：詹春兰串请学位级别：硕士学科专业：研究方向：生物化学与分子生物学论文提交日期：2015年4月7日论文答辩日期.•2015年6月5日学’位授予单位：集美大学学位授予日期：2015年6月答辩委员会主席：论文评阅人:学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包穴其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此论文产生的权

2、利和责任。声明人（签名）：保护知识产权声明本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容作者（签名）导师（签名)时间：硕士学位论文刺参丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的克隆、表达及性质分析MolecularCloning,ExpressionandCharacterizationofSerineProteinaseandMetalloproteinasefromSeaCucumber

3、Stichopusjaponicus学科门类：理学作者姓名：詹春兰指导教师：曹敏杰教授学科专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学学位授予单位：集美大学论文答辩日期：2015年6月5日刺参丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的克隆、表达及性质分析摘要刺参作为滋补食品和药膳饮食，深受人们的喜爱。然而，刺参在捕捞、运输和加工过程中极易发生自溶，给相关行业造成重大经济损失。前期研究表明，刺参内源性蛋白酶参与其自溶过程。目前为止，国内外对于刺参自溶酶的基因信息及结构特征研究甚少。基于为国内外学者在该领域的探索提供理论基础，本论文以刺参为研究对象，首次从刺参内脏中克隆得到丝氨酸蛋白酶

4、（serineproteinase,SP）和基质金属蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2,MMP-2）的基因序列，并利用基因工程技术实现SP和MMP-2的体外表达，获得有活性的重组蛋白酶，同时对其进行性质分析。根据已获得的刺参内脏SP部分氨基酸序列设计特异性引物，利用RT-PCR和RACE技术获得其基因全长共1367bp，包括44bp5’端非编码区和192bp3’端非编码区。其ORF138176325为1131bp，编码377个氨基酸残基，其中Asp、His和Ser构成SP的催化三联体。刺参SP属于Subtilisin家族丝氨酸蛋白酶，其

5、三级结构中含有6个平行的β折叠片，被两侧的α螺旋包围，形成典型的“三明治”结构，此外，在SP的C端还有2个β折叠型结构域参与蛋白质的正确折叠等过程。进一步利用大肠杆菌表达系统体外表达重组刺参SP，通过HisTrap亲和柱层析得到大量高度纯化的重组刺参SP。利用重组刺参SP制备特异性多克隆抗体，进一步将具有良好效价和特异性的兔抗重组刺参SP特异性多克隆抗体与CNBr-activatedSepharose4B亲和柱偶联，制备亲和层析柱纯化得到一部分纯度较高的天然SP。同时通过构建重组质粒pPIC9K-SP并转入毕赤酵母中，利用甲醇诱导表达，获得分子量为70kDa的有活

6、性的重组刺参SP。根据MMPs保守序列设计引物，首次扩增得到刺参MMP-2酶原的基因序列。刺参MMP-2酶原包括前肽结构域、催化结构域以及类血红素结构域。催化结构域中包含3个相同的II型纤连蛋白，其和类血红素结构域在空间上都是较独立完整的，类血红素结构域通过铰链区与催化结构域相连接。利用大肠杆菌表达刺参MMP-2催化结构域，并通过HisTrap亲和柱层析纯化得到分子量约为40kDa的目的蛋白。通过稀释复性，重组蛋白能够进行正确折叠，首次获得了大量有活性的重组刺参MMP-2。进一步利用明胶酶谱法对重组刺参MMP-2进行性质研究，结果显示重组刺参MMP-2在35°C~

7、40°C活性最高，在pH7.5~9.02+条件下都具有一定的酶活性，最适pH为8.0。此外，适量的金属离子Ca可以显著激活重组刺参MMP-2的酶活性。以上结果表明重组刺参MMP-2是一种弱碱性蛋白酶，属于钙离子依赖型金属蛋白酶，与天然MMP-2相似。关键词丝氨酸蛋白酶；基质金属蛋白酶-2；刺参；基因克隆；体外表达；明胶酶谱IMolecularCloning,ExpressionandCharacterizationofSerineProteinaseandMetalloproteinasefromSeaCucumberStichopusjaponicusAbstr

8、actSe