猪带绦虫组织蛋白酶b基因的克隆、表达及功能研究

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1、密级：论文编号：中囯农业科学院学位论文猪带绦虫组织蛋白酶B基因的克隆、表达及功能研究Cloning,ExpressionandCharacterizationofCathepsinBfromTaeniasolium硕士研宄生.•孙铭苑指导教师：才学鹏研宄员申请学位类别：农学硕士专业：»兽医学研宄方向：魂培养单位：兰州兽医研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationCloning,ExpressionandCharacte

2、rizationofCathepsinBfromTaeniasoliumMS.Candidate：SunMingyuanSupervisor：ProfessorCaiXuepengMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:AnimalVaccinesandMolecularImmunologyMay2015摘要猪囊尾蚴能够引起猪和人的囊虫病，影响养猪业的发展和人类的健康。组织蛋白酶B是半胱氨酸蛋白酶家族成员，在寄生虫的营养、生长发育、组织迁移、蛋白加工和活化以及免疫逃避等方面

3、发挥重要作用，是预防及治疗多种寄生虫疾病的潜在的药物靶标和疫苗候选分子。本文对猪带绦虫组织蛋白酶B基因进行了克隆、表达及功能的初步研究。取得了以下结果：1.以猪带绦虫的cDNA为模板，成功地扩增了猪带绦虫组织蛋白酶B基因（TscpB）。利用生物信息学工具，对该序列进行分析。结果表明该基因ORF大小为1074bp，编码357个氨基酸，理论分子质量为39.27ku，具有组织蛋白酶B的特征结构域。Real-timePCR结果表明，组织蛋白酶B基因在成虫期表达量显著高于囊尾蚴时期。2.构建了原核表达重组质粒pET30a-Tscp

4、B，经诱导表达，获得了以包涵体形式存在的重组蛋白rTscpB，分子大小约为38ku。Westernblotting分析表明，rTscpB能被猪囊尾蚴病阳性血清特异性识别。用纯化后的rTscpB免疫家兔，4次免疫后产生了特异性的高滴度IgG抗体。免疫组化结果表明，rTscpB主要表达于成虫的体壁及生殖器官，证明猪带绦虫组织蛋白酶B可能与虫体摄取营养以及生殖发育有关。3.构建了毕赤酵母真核表达重组质粒pPIC9K-TscpB。明胶酶谱实验证明yTscpB具有水解活性，且能够降解荧光底物Z-Phe-Arg-AMC，最适pH为5

5、.5。yTscpB还能降解猪IgG、BSA、纤连蛋白等大分子。yTscpB的水解活性能被E-64特异性抑制。底物实验表明猪带绦虫组织蛋白酶B可能在摄取营养、入侵宿主等方面发挥作用。4.利用同源模建的方法预测了猪带绦虫组织蛋白酶B蛋白的结构，利用分子对接的方法预测了组织蛋白酶B蛋白与抑制剂E-64之间相互作用的模式。关键词：猪带绦虫，组织蛋白酶B，免疫定位，酶活力，同源模建IIIAbstractTaeniasoliummetacestodes,thatcancausecysticercosisinpigsandhumans

6、,seriouslyaffecttheproductionofpigsandthehealthofhumanbeings.CathepsinBisoneoftheimprotantmembersofcysteineproteases.ItwasprovedbymanypreviousstudiesthatcathepsinBhadavarietyoffunctionsinparasitepathogenicityandfacilitatedparasiteevasionfromhostimmuneresponses,es

7、sentialnutrientuptakeandtissuepenetration,whichcontributestheenzymeapromisingtargetforchemotherapyorimmunoprophylaxis.Therefore,thisresearchwasfocusedonthecloning,expressionandcharacterizationofcathepsinBgenefromT.solium.Wehaveachievedthefollowingresults:1.Making

8、useofthecDNAofT.soliumasatemplate,wefirstamplifiedcathepsinBgene.Wealsousedbioinformatictoolstoanalyzethegenesequence.ThesequenceanalysisshowedthatitsORFwas107