猪带绦虫烯醇化酶基因的克隆、原核表达及功能研究

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1、万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：一一圮易昏时间：少t争年矿／3日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位

2、论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：／多够角时间：≯．垆年多月B日钠獬：为vv八．帅：印中年多刖如万方数据本文是家畜疫病病原生物学国家重点实验室自主课题资助项目“猪带绦虫基因组和转录组的测序研究”的部分研究成果(项目编号：SKIⅦB2011ZZKT007)课题主持人：才学鹏研究员(中国农业科学院兰州兽医研究所)万方数据猪带绦虫烯醇化酶基因的克隆、原核表达及功能研究摘要猪囊尾蚴是带科带属的猪带绦虫(Taeniasoliu

3、m)幼虫，常见于肌肉组织，引起猪和人的囊虫病，进而影响养猪业的发展和人类的健康。由于寄生环境的影响，猪带绦虫以糖酵解为主，进行物质和能量代谢。烯醇化酶(enolase，ENO，酶分类编号：EC4．2．1．11)是一种多功能蛋白，广泛存在于许多生物体内，不仅作为糖酵解酶影响细胞的物质和能量代谢，又具有参与病原体入侵宿主、免疫刺激蛋白及热激蛋白等多种功能。因此，本文对enolase进行了克隆、表达及功能的研究。取得如下结果：1．以猪带绦虫的cDNA为模板，首次扩增获得猪带绦虫enolase基因。Real-timePCR结果表明，enolase在成虫期表达量高。利用生物信息学

4、软件，对该基因进行序列分析。序列分析表明该基因ORF大小为1302bp，编码433个氨基酸，理论分子质量为46．56l(1l，分析了猪带绦虫烯醇化酶可能的纤溶酶原结合基序(238GKVKIGMDVAASEFYQDGKYNLDF261)。2．成功构建了重组表达质粒pET-30a(+)-ENO，并获得了以可溶性形式高效表达的重组蛋白rTsENO，大小约为53ku。Westernblotting检测结果表明，rTSENO能被猪囊尾蚴病阳性血清特异性识别。配基试验、纤溶酶原激活试验及竞争性试验结果表明：rTsENO具有良好的纤溶酶原结合能力；当存在纤溶酶原激活剂t-PA时，rT

5、sENO促进纤溶酶原被激活并产生纤溶酶；6-ACA可以抑制rTsENO与纤溶酶原的结合。3．应用rTsENO免疫家兔，经4次免疫后，家兔产生了高滴度的特异性IgG抗体。免疫组化试验结果表明，rTsENO主要在成虫的体壁及生殖器官内表达。4．在不同底物浓度、不同rTsENO浓度、不同pH值及不同金属离子存在条件下，利用紫外分光光度计，连续检测rTsENO在240nm时磷酸烯醇式丙酮酸吸光度的增加量或减少量。结果表明：以2-PGA为底物所测的rTsENO比活力为60．724-0．84U(mgprotein)～，以PEP为底物所测的rTsENO比活力为22．644-1．05U

6、(mgprotein)-1。rTSENo的最佳pH值范围是7~7．5。在金属离子存在时，rTsENO才具有酶活力，_且M92+存在时，rTSENo酶活力最高。NaCI、MgCl2和CaCl2均具有抑制rTsENO酶活力的作用。在以2-PGA为底物时，50,--200mmol／LKCI对rTsENO酶活力有轻微激活作用；以PEP为底物时，在检测浓度范围内，KCI均呈现抑制作用。综上所述，重组表达的猪带绦虫烯醇化酶(rTsENO)能被猪囊尾蚴病阳性血清特异性识别，具有良好的纤溶酶原结合能力及酶活力。这为进一步阐明猪带绦虫的代谢、入侵及致病机理奠定了理论基础。关键词：猪带绦虫

7、；烯醇化酶；表达；免疫定位；纤溶酶原；酶活力万方数据GeneCloning，ProkaryoticExpressionandCharacterizationofEnolasefromTaen缸soliumAbstractThelarvalstageoftheTaeniidaeTaenh7soliummainlyinfectsmuscletissues．whichcancausecysticercosisinpigsandhumans．therebyaffectingtheproductionofpigsandthehealthofhuma