p53基因的克隆、原核表达及功能初步研究

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1、论文题目：学科专业：学位申请人：指导老师：p53基因的克隆、原核表达及功能初步研究动物学李春炎李兴玉教授摘要目的原核表达P53重组蛋白，检澳t]P53重组蛋白对人类白血病细胞系K562和人肝癌细胞系SMMC．7721体外增殖的影响。方法运用PCR技术鉴定]"pET-p53重组质粒导,KBL21菌株中p53基因的存在，并在IPTG的诱导下，大量产生外源基因产物。通过Ni．NAT亲和层析柱纯化分离P53蛋白，SDS．PAGE确定该蛋白准确性。以不同浓度经磁性荧光纳米粒子(FMNP)修饰后的P53重组蛋白诱导K562细胞和SMMC

2、．7721细胞，用M'Iq'LI',色法、集落形成法、流式细胞术(FCM)测定P53蛋白对靶细胞增殖的影响。利用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察经磁性荧光纳米粒子修饰的P53重组蛋白在细胞中的定位。结果1．成功的构建了含人野生型p53基因的原核表达载体，分离纯化了P53重组蛋白。2．磁性荧光纳米粒子修饰的P53重组蛋白较未修饰的蛋白有更好的凋亡诱导作用，且磁性纳米粒子本身并不具细胞毒害作用；3．P53重组蛋白抑制l(562肿瘤细胞的生成，随药物剂量增大：细胞凋亡率上升，其半数抑制浓度(IC50)为6．74／比g／ml；4．随

3、着P53重组蛋白浓度的增加，SMMC．7721细胞存活率显著降低，并发现该蛋白能促进肿瘤细胞凋亡，且呈现明显的剂量依赖性，其半数抑制浓度(IC50)为12．39／tg／ml；5．激光共聚集显微镜观察发现P53重组蛋白主要定位于细胞核，胞浆也有少量分布。结论原核表达的P53重组蛋白具有野生型P53(wtp53)蛋白活性，体外实验发现经磁性荧光纳米粒子修饰的P53重组蛋白能够抑制I为62细胞和SMMC．7721细胞生长并促使它们发生凋亡。关键词：p53基因；细胞凋亡；磁性荧光纳米粒子Title：CloningandProkary

4、oticExpressionofp53geneandPreliminaryStudyofItsFunctionMajor：ZoologyApplication：LiChun-yanSupervisor：Prof．LiXing-yuAbstractObjectiveToexpressandpurifypET—p53fusionproteinandinvestigatetheeffectsoftheproteinontheproliferationofHumanleukemiacelllineK562andHumanhepato

5、cellularcarcinomacelllineSMMC-7721／nvitro．MethodsThefragmentofhumanwildtypep53eDNAwasamplifiedbyPCRandtheexpressionplasmidofpET-p53wasconstructed．RecombinantplasmidsweretransformedintoE．coliBL21，theninducedbyIPTGatlmmol／LTheproteinwaspurifiedbythecolumnofNi—NATanda

6、nalyzedbySDS-PAGE．Aftertreatedwithfluorescentmagneticnanoparticles(FMNP)modifiedP53proteinwithdifferentconcentrations，theproliferationofK562weretestedbyMTrassay，cloneformationandFCM．Wealsousedlaserscanningconfocalmicroscope(LSCM)toobservethedistributionoffluorescen

7、tmagneticnanoparticlesmodifiedP53fusionproteinincells．ResultsProkaryoticexpressionvectorsofpET-p53wereconstructedcorrectly．pET-p53fusionproteinweresuccessfullyexpressedandpurified．Withitsincreasingconcentrations，modifiedP53fusionproteinreverseditseffectontumorcells

8、significantly．TheratioofinhibitionwaslinearrelationtotheconcentrationofP53●fusionproteinwhenconcentrationoftheproteinwasbetween0．1／tg／mland100／比g