《基因克隆原核表达》PPT课件

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1、基因的克隆与表达山东大学医学院免疫学研究所马春红基因克隆(geneclonging)基因表达(geneexpression)-原核基因表达-真核基因表达基因克隆GeneCloning概述克隆载体受体细胞体外重组的策略基因克隆工作流程一、概述1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件：限制性内切酶连接酶载体受体细胞基因克隆（分子克隆molecullarcloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子

2、代分子的过程。基因克隆的核心-----体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。基因克隆的技术路线目的基因载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA二、克隆载体三、受体细胞1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、要求：易于接纳外源DNA无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性四、体外重组的策略1、粘末端连接1）全同源粘末端连接最方便简单高背景-载体自身环化双向插入2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的

3、克隆策略粘-粘连接：最有效、最快捷粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平2、平末端连接：酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA效率低，酶用量大3、人工接头连接人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段4、T-A克隆T-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中，增加延伸时间，Taq酶可在产物的3’端多加一个A五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的获得1、直接分离3、构建cDNA文库4、PCR5、人工合成6、差异显示1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库2

4、、构建基因组文库，筛选目的基因基因组文库(genelibrary)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况3、构建cDNA文库，筛选目的基因cDNA文库(compl

5、ementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选4、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法5、人工合成较短的DNA6、差异显示法(differentialdisplay,DD)—筛选差异表

6、达的基因（二）体外重组连接体系的建立：温度：粘末端连接：12-18℃平末端连接：室温（低于30℃)DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3酶量：平端连接时需加大酶量（三）转化—Cacl2法、电击法（四）重组子的筛选及鉴定1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）原位杂交2、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR方向鉴定：联合酶切测序原核基因表达系统一．表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。据受体细胞的不同可分为：1．原核表达载体系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞

7、中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。二．原核生物基因结构和表达特点原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。多顺反子mRNA（polycistronicmRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。操纵子（operon）：

8、是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。包括：调控区(调节基因，启动基因，操作基因)、结构基因：5、原核生物中参与转录的基因结构：启动子终止子启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。一般长40-60bp，富含A-T硷基对