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基因的克隆与表达山东大学医学院免疫学研究所马春红 基因克隆(geneclonging)基因表达(geneexpression)-原核基因表达-真核基因表达 基因克隆GeneCloning 概述克隆载体受体细胞体外重组的策略基因克隆工作流程 一、概述 1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件:限制性内切酶连接酶载体受体细胞 基因克隆(分子克隆molecullarcloning)----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体,并导入受体细胞,扩增形成大量子代分子的过程。 基因克隆的核心-----体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 基因克隆的技术路线目的基因载体体外重组重组子(杂合DNA)转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增,获得子代DNA 二、克隆载体 三、受体细胞1、定义:外源DNA导入的细胞,是重组体扩增的场所。2、要求:易于接纳外源DNA无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性 四、体外重组的策略1、粘末端连接1)全同源粘末端连接最方便简单高背景-载体自身环化双向插入 2)定向克隆:使外源基因定向插入到载体中的克隆策略粘-粘连接:最有效、最快捷粘-平连接:适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点,可将另一末端补平 2、平末端连接:酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA效率低,酶用量大 3、人工接头连接人工接头:人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段 4、T-A克隆T-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中,增加延伸时间,Taq酶可在产物的3’端多加一个A 五、基因克隆的工作流程(一)目的基因的获得1、直接分离3、构建cDNA文库4、PCR5、人工合成6、差异显示 1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库 2、构建基因组文库,筛选目的基因基因组文库(genelibrary):将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞,进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库,它包含了该生物的所有基因。 构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法) 特点及应用:包含所有遗传信息构建难度大(单拷贝基因、长片段基因)筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况 3、构建cDNA文库,筛选目的基因cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板,反转录合成双链cDNA,各cDNA分子分别插入载体形成重组子,再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。 cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少,易筛选 4、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板,直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法 5、人工合成较短的DNA6、差异显示法(differentialdisplay,DD)—筛选差异表达的基因 (二)体外重组连接体系的建立:温度:粘末端连接:12-18℃平末端连接:室温(低于30℃)DNA量:载体分子数/目的基因分子数=1:1-3酶量:平端连接时需加大酶量 (三)转化—Cacl2法、电击法(四)重组子的筛选及鉴定1、筛选:平板法(抗生素、蓝白斑)原位杂交2、鉴定:长度鉴定:酶切、PCR方向鉴定:联合酶切测序 原核基因表达系统 一.表达系统:基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系,包括克隆载体,表达载体及受体细胞。 据受体细胞的不同可分为:1.原核表达载体系统:将外源基因引入原核细胞,并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2.真核表达系统:使外源基因在真核细胞中表达的体系。 二.原核生物基因结构和表达特点 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA,其转录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形成多顺反子mRNA:mRNA在合成过程中和多个核糖体结合,翻译形成多条肽链。 多顺反子mRNA(polycistronicmRNA):即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA 3、一般不含内含子(intron),没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起,形成操纵子。 操纵子(operon):是一组功能上相关,受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 原核生物基因表达的基本单位(即一个转录单位)。共同协调作用,完成某一多肽的表达调控。包括:调控区(调节基因,启动基因,操作基因)、结构基因: 5、原核生物中参与转录的基因结构:启动子终止子 启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。一般长40-60bp,富含A-T硷基对共有保守序列:-10区(pribnowbox):TATAAT-35区: RNA聚合酶识别并结合启动子,但并不开始转录各种启动子启动转录能力不同。启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 终止子(terminator,T):位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 富含GC的反向重复序列富含AT的序列转录形成发夹式结构 6、与转译有关的原核细胞结构:——核糖体结合位点转译起始密码子AUGSD顺序(shine-dalgarno):AUG上游3-11bp长约3-9bpmRNA与30s核糖体亚基间的识别与结合序列 三.外源基因在原核表达系统中表达的必要条件:删除内含子和5’非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架(ORF)mRNA稳定且可有效转译,形成的蛋白质不被降解 四.影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素:1、启动子:建立表达载体时,选择强启动子。 常见原核强启动子:Plac:受Lac阻遏蛋白负调,受IPTG的诱导Ptrp:取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子:噬菌体早期左/右向启动子,受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。 2、基因剂量:3、核糖体结合位点:SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。AUG—SD间距离。AUG后的核苷酸 四.原核表达载体:适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件:强启动子SD顺序筛选标志其它调控基因 类型:融合型表达载体:----融合蛋白非融合型表达载体:---天然完整蛋白分泌型表达载体:----产物可跨膜分泌至胞周间隙 (一)融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因 1、主要元件:强启动子SD原核基因3’端 2、技术关键:克隆基因插入原核序列近3’端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点:加人工合成的DNA接头构建位相载体 ----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA载体部分序列DNA序列 位相载体----含有3种读码框的系列载体 3、优点:表达效率高产物稳定易鉴定:融合蛋白分子量大,电泳可鉴定易纯化:利用融合原核多肽的特性 Ptac:IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便:pGEX-1T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子位相载体融合型载体----pGEX系列 (二)非融合型表达载体PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因 主要元件:强启动子SD:ATG:第一个密码子 非融合型表达载体----pPL-LamdaPL启动子---温度诱导插入位点--HpaI (三)分泌型表达载体:1、主要元件:启动子和SD序列信号肽序列:SD下游,编码信号肽,可引导蛋白跨膜2、优点:分泌表达,避免降解。 分泌型表达载体----pINIII-ompA1 分泌型融合表达载体----pEZZ18 五.提高表达水平的手段1、选择合适载体强启动子----提高转录水平核糖体结合位点(ATG---SD)避免产物降解:分泌/融合表达细菌蛋白酶抑制剂 2、选择合适宿主Lac启动子----LacI菌PL/PR--------CI857溶源菌 3、诱导表达温度诱导------PL/PRIPTG的化学诱导----Plac、Ptac 六.表达产物的检测:1、特异性鉴定:荧光抗体法免疫沉淀法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定
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