幽门螺杆菌ahpc基因的克隆与原核表达

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1、幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达作者：李艳青，段广才，宋春花，张建光，王淑玲，张卫东，郗园林【摘要】目的构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)ahpC基因的原核表达系统，表达并纯化Ahp蛋白。方法用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段，将目的基因插入表达载体pET-30a中，构建重组质粒pET30a-ahpC。重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白，并用

2、SDS-PAGE鉴定。结果PCR扩增的ahpC基因长度为594bp，经酶切和测序分析，插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%；SDS-PAGE显示，经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白，且产量较高。结论成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC，并在大肠杆菌中高效表达。【关键词】幽门螺杆菌；ahpC基因；克隆；基因表达ChinaABSTRACT:ObjectiveToconstructaprokaryoticexpressionsystemofahpCgeneof

3、Helicobacterpylori.MethodsTheahpCgenewasamplifiedfromHpchromosomalDNAbyPCRtechniqueandclonedintotheexpressionvectorpET-30a.TherecombinantvectorpET30a-ahpCwasidentifiedbyDNAsequencing10andtransformedtoE.coliBL21(DE3)forexpressionunderinductionbyIPTG.T

4、heexpressionproductwasanalyzedbySDS-PAGE.ResultsPCRproductshowedthatahpCgeneconsistedof594bp.ThegenefragmentthatwasinsertedintotherecombinantvectorwasidentifiedtoGenBankfor99%.SDS-PAGEshowedthattheinducedproteinwasexpressedhighlyinthehostbacterium.Co

5、nclusionAprokaryotichigh-expressionsystemforahpCgenehasbeensuccessfullyconstructed.Itcanhighlyexpressr-AhpCproteininE.coli.　　KEYWORDS:Helicobacterpylori;ahpCgene;cloning;geneexpression　　幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是一种定植于人类胃黏膜的革兰染色阴性、螺旋状、微需氧菌，是慢性胃炎、消化

6、性溃疡的病原体，也与胃腺癌及黏膜相关性淋巴瘤的发生密切相关[1-4]。全世界范围内Hp的感染率超过50%[5]。Hp是一种对氧敏感的微需氧菌，菌体内还有多种抗氧化蛋白，其中烷基过氧化氢物还原酶(Ahp)最为丰富，其作用是通过在高氧化环境中还原有毒的氢化氧化物来实现的。Ahp由ahpC基因编码，是抗氧化酶家族peroxiredoxins(prxs)的成员之一[6]。本研究利用基因克隆技术，将编码HpahpC外膜蛋白的基因经PCR扩增后，构建重组载体，并在E.coli10BL21(DE3)中进行表达

7、和纯化，为进一步研究奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　幽门螺杆菌中国分离株MEL-Hp27(简称Hp27)及质粒pET-30a由本实验室培养和保存；镍柱、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)购自创生公司；限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、pMD18-TVector、Proteinmarker、T4DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker、细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA电泳胶回收、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。引物合

8、成由北京赛百盛生物工程公司完成，DNA测序由北京三博远志生物有限责任公司完成。其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1Hp基因组DNA的提取　　刮取经3d培养的Hp培养板上的Hp，以12000r/min离心1min，取沉淀按细菌基因组抽提试剂盒操作方法提取HpDNA。10　　1.2.2AhpC编码基因的扩增　　根据GenBank上公布的HpahpC基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列为：5′-CGCATATGTTAGTTACAAAA