幽门螺杆菌ahpc基因的克隆与原核表达

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1、幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是一种定植于人类胃黏膜的革兰染色阴性、螺旋状、微需氧菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的病原体，也与胃腺癌及黏膜相关性淋巴瘤的发生密切相关[1-4]。全世界范围内Hp的感染率超过50%[5]。Hp是一种对氧敏感的微需氧菌，菌体内还有多种抗氧化蛋白，其中烷基过氧化氢物还原酶(Ahp)最为丰富，其作用是通过在高氧化环境中还原有毒的氢化氧化物来实现的。Ahp由ahpC基因编码，是抗氧化酶家族peroxiredoxins(prxs)的成员之一[6]。本研究利用基因克隆技术，将编码H

2、pahpC外膜蛋白的基因经PCR扩增后，构建重组载体，并在E.coliBL21(DE3)中进行表达和纯化，为进一步研究奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　幽门螺杆菌中国分离株MEL-Hp27(简称Hp27)及质粒pET-30a由本实验室培养和保存；镍柱、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)购自创生公司；限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、pMD18-TVector、Proteinmarker、T4DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker、细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA电泳胶回收、质粒抽提试剂盒购自天

3、根生化科技(北京)有限公司。引物合成由北京赛百盛生物工程公司完成，DNA测序由北京三博远志生物有限责任公司完成。其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1Hp基因组DNA的提取　　刮取经3d培养的Hp培养板上的Hp，以12000r/min离心1min，取沉淀按细菌基因组抽提试剂盒操作方法提取HpDNA。　　1.2.2AhpC编码基因的扩增　　根据GenBank上公布的HpahpC基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列为：5′-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3′，下划线为Nde

4、Ⅰ酶切位点；P2的序列为：5′-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT-3′，下划线为XhoⅠ酶切位点。以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共循环35次，最后于72℃延伸5min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，观察扩增结果并用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。　　1.2.3重组载体的构建　　回收的PCR产物与pMD18-T按照载体与插入DNA的摩尔比为1∶6的比例混合后，置16℃连接过夜，体系为pM

5、D18-T载体1μL、PCR产物2μL、双蒸水2μL、连接液5μL。经蓝白斑筛选鉴定的pMD18T-ahpC和表达载体pET-30a用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收后，用T4DNA连接酶于22℃进行连接，pET-30a片段与插入DNA的摩尔比为1∶(1～3)。连接后的重组表达载体pET30a-ahpC再经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　1.2.4重组质粒的转化　　将重组载体pET30a-ahpC转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建的重组工程菌涂布含卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃培养12～

6、16h，挑选单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置37℃摇床振荡培养12h。抽提质粒，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA碱基序列测定由北京三博志远生物有限责任公司完成。　　1.2.5重组载体在E.coli中的表达　　取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养至A600达到0.5时，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG诱导，于诱导过程中取样，同时作空载体菌对照，采用SDS-PAGE电泳分析重组AhpC的表达。优化诱导表达条件,用UVP凝胶成像系统分析重组蛋白的相对含量。1.2.6

7、表达纯化rAhpC蛋白　　将大量诱导的细菌4℃4000g离心收集细菌，PBS洗菌1次，重悬于纯水中，-20℃过夜后超声破碎，12000g离心，收集上清及沉淀。使用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，SDS-PAGE电泳检查蛋白纯化效果。　　2结果　　2.1HpahpC编码基因的扩增　　以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板进行PCR扩增，所获PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，在600bp附近有单一条带，片段的大小与预计相符(图1)。　　2.2重组载体的酶切鉴定科技论文发表X站　　回收幽门螺杆菌ahpC基因的PCR产物，与pMD18-T

8、连接后转化感受态DH5α受体菌，经蓝白斑筛选试验挑取