果胶裂解酶基因的克隆与原核表达

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1、食品科技生物工程FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY2010年第35卷第9期果胶裂解酶基因的克隆与原核表达1,22*13122宋立立，顿宝庆，奚亚军，彭源德，白娜，路明，李桂英(1.西北农林科技大学农学院，杨凌712100；2.中国农业科学院生物质能源研究中心，北京100081；3.中国农业科学院麻类研究所，长沙410205)摘要：利用PCR技术从枯草芽孢杆菌T66(Bacillussubtilis)基因组DNA中扩增得到果胶裂解酶编码基因pl(GU644446)，并构建基因表达载体pPAL7-pl重组质粒，转化受体菌E.coliBL21进行原核表

2、达分析。诱导表达条件为温度37℃、时间4h、IPTG浓度0.8mol/L，经SDS-PAGE分析表明果胶裂解酶编码基因pl表达的重组酶蛋白相对分子质量为45ku。对该基因重组酶粗酶液的酶学性质进行了初步分析，表明该酶最适反应温度为50℃、最适反应pH8，添加5.5mmol/L的2+Ca的条件下，测得果胶裂解酶的最高比酶活为30U/mL。含有果胶裂解酶编码基因pl的重组质粒遗传稳定。关键词：果胶裂解酶；基因克隆；原核表达；酶学特性中图分类号：TS201.2文献标志码：A文章编号：1005-9989(2010)09-0002-06Cloningofgeneenco

3、dingpectinlyaseandexpressioninprokaryoticSONGLi-li1,2,DUNBao-qing2*,XIYa-jun1,PENGYuan-de3,BAINa1,LUMing2,LIGui-ying2(1.CollegeofAgronomyofNorthwestA&FUniversity,Yangling712100;2.BiomassEnergyResearchCenter,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081;3.InstituteofBastFiberCro

4、ps,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410205)Abstract:WithgenomicDNAofBacillussubtilisasatemplate,pectinlyasecodinggeneplwasobtainedbyPCRamplification.ThevectorpPAL7-plwasconstructedandtransformedintotherecipientbacteriumE.coliBL21.Itwasexpressedunderat37℃,inductionwith0.8

5、mol/LIPTGfor4h.SDS-PAGEanalysisrevealedthatrecombinantstrainharboringtheplasmidpPAL7-plcouldexpressthetargetprotein(45ku).Preliminarystudyonenzymaticpropertiesofrecombinantproteinshowthatoptimumtemperatureforpectatelyaseactivitywas50℃andoptimumpHforpectatelyaseactivitywas8.Theactivi

6、tyofpectatelyasewas30U/mLbyadding5.5mmol/LCa2+.Afterseveralsubsequentculture,thegeneticofrecombinantplasmidwasstable.Keywords:pectatelyase;genecloning;prokaryoticexpression;enzymaticproperties收稿日期：2010-02-23*通讯作者基金项目：国家科技支撑计划项目(2007BAD41B02)；农业部农村能源综合建设项目(2130138-018)；中央级公益性科研院所基本科研

7、业务费专项资助项目(2060302-13)。作者简介：宋立立(1983—)，女，河北沧州人，硕士研究生，主要从事农业生物技术研究的工作。·2·食品科技2010年第35卷第9期FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY生物工程果胶酶是广泛存在于果实及多种微生物中可DNA提取试剂盒：天根公司；其他试剂：国产分以作用于果胶质的一类由许多单酶组成的复合酶析纯。[1]的总称。果胶酶在苎麻脱胶、木材防腐和酒精发1.2方法酵等领域有重要的应用意义，并且广泛应用于食1.2.1LB培养基配置和培养条件LB培养基配置品工业。参见文献[8]。转化子的选择用含有氨苄青霉素(10

8、0果胶裂解酶是果胶酶的重要组成部分，能