麻类脱胶高效菌株果胶裂解酶基因克隆与表达.pdf

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1、微生物学通报Aug．20，2013，40(8)：1403—1413MicrobiologyChina◎2013byInstituteofMicrobiology．CAStongbao@im．ac．cn麻类脱胶高效菌株果胶裂解酶基因克隆与表达成莉凤刘正初段盛文冯湘沅郑科郑霞程毅(中国农业科学院麻类研究所湖南长沙410205)摘要：【目的】克隆麻类脱胶高效菌株Dickeyasp．DCE一01的果胶裂解酶基因并进行原核表达，对表达产物进行纯化和酶学性质研究。【方法】根据该菌株全基因组序列预测的果胶裂解酶基因Q59419设计引物，PCR扩增后将该基

2、因连接到pEASY-E1和pACYCDuet一1载体上，导入E．coliBL21(DE3)进行表达。选择酶活力高的阳性克隆子进行大量诱导表达后，采用超滤和SephadexG—lo0凝胶层析两步法纯化出果胶裂解酶，研究其酶学性质。【结果】克隆到果胶裂解酶基因pel(GenBank登录号：JX964997)，其序列全长1128bp，编码375个氨基酸。pACYCDuet一1-pel-BL表达胞外果胶裂解酶活力最高，发酵液粗酶活达298．8IU／mL。其最适反应温度为50。C，最适pH为9．0；保温lh，酶活稳定温度≤45。C，稳定pH为9．0-

3、10．0。酶催化作用依赖于ca2+，其最适作用浓度为2mmol／L；Zn2+、Ca和NH4+促进酶活力，Fe。和Pb严重抑制酶活力；聚半乳糖醛酸钠为该酶的最适底物。【结论】从麻类脱胶高效菌株中发掘到碱性果胶裂解酶基因，其表达产物在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景。关键词：麻类脱胶，高效菌株，果胶裂解酶，基因克隆，酶学性质基金项目：国家863计划项目(No．2006AA02Z249)；国家麻类产业技术体系建设专项项目(No．CARS一19一E24)通讯作者：Tel：86—731—88998535；Fax：86-731．88998528；

4、函：ibfclzc@189．cn收稿日期：2012—10．31：接受日期：2012．12．061404微生物学通报Microbio1．China2013，Vo1．40，No．8~J⋯51oninganc1Iexpressl●on0tnapect-ate一lyasegenef一romaneficientstrainforbastfiberbio-·extractingCHENGLi-FengLIUZheng．ChuDUANSheng—WenFENGXiang．YuanZHENGKeZHENGXiaCHENGYi(InstituteofBast

5、FiberCrops，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changsha，Hunan410205，China)Abstract：【Objective1Weclonedandexpressedthepectatelyasegenee1)fromDickeyasp．DCE一01astrainforbastfiberbio—extracting，inE．coliBL21(DE3)．Thenwecharacterizedthepurifiedpectatelyase(Pe1)．【Methods】Primers

6、weredesignedbythepotentialpelQ59419annotatedfromthewholegenomesequenceofDickeyasp．DCE一01．ThepelwasclonedlinkedtopEASY-E1andpACYCDuet一1，andexpressedinE．coliBL21(DE3)．Aftercompar—ingtheactivitiesofextracellularPelfromtheengineeringstrains，thePelwithhighestactivitywaspurified

7、bythetwo—stepprocessinvolvingultrafiltrationandgelfiltration(SephadexG一100)andthencharacterized．【ResultslThepel(GenBank：JX964997)was1128bpandencoded375aminoacids．ThehighestactivityoftheextracellularPelfrompACY—CDuet一1-pel—BLstrainwas298．8IU／mL．Theoptimalconditionforthepuri

8、fiedenzymewasat5O。C，pH9．0andpolygalacturonicacidsodiumasasubstrate．Thecatalyticactivityof