柑橘果胶酯酶的基因克隆

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1、柑橘果胶酯酶的基因克隆食品科学专业研究生叶华指导教师马力摘要果胶酯酶(EC：3．1．1．11)是果胶酶的一种，它是一种能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇的酶，英文名为pectiIlesterase，又称PectinMethylestemse、Pectindemethoxylase或PectinMethoxyIase。英文简称PE或PME。国际酶委员会将它妇类为果胶一果胶酰基水解酶。它存在于所有植物组织中。一些酶菌和细菌，如能引起软腐病的欧氏杆菌、干蓝黑腐黄杆菌和甘蔗流胶病黄杆菌等也能产生PE。果胶酯酶是一种广泛使用的工业酶类，主要用于果蔬饮料加工业中。目前，对果胶酯酶用于制备

2、低酯果胶的研究也越来越受到人们的重视。对果胶酯酶基因方面的研究，国内鲜有报道，而在国外却是研究热点之一。本文对柑橘皮中的PME进行了研究。具体研究结果如下：1．根据核苷酸序列分析结果设计引物，利用RT-PCR技术从柑橘皮组织总RNA中扩增获得PME基因，并成功地克隆到pGEMTeasy载体上，基因全长为1797bp，开放阅读框架长1785bp，编码594个氨基酸。序列分析表明：氨基酸序列中含有5个潜在的糖基化位点，在29到48位之问可能是信号肽区域。其最大可能剪切(mostlikelycleavagesite)位点可能在45和46位之问即：VV卜ff。大约在2(】一50位氨

3、基酸之问含有一个典型的疏水性区域。这很有可能含有一个跨膜区。但是亲水性分析表明该PME序列具有高度亲水性。另外通过序列对比分析发现PME基因含有四个非常保守的cys残基，笔者认为这个四个保守的cys残基参与二硫桥的形成，因此与PMF结构有很大关系。2．通过clustalw软件分析表明，该PME基因其实就是可隆正确的citrussinensis的csPME4基因。但是它与Citrussinensis其他的PME基因在进化上有很大差别，从而他们的性质应该有很大不同，而这与文献报道的csPME4是一种不同于另外两种PME的热稳定性酶一致。同时，根据进化分析表明，笔者认为在亚麻(u

4、numusitatissimum(nax))中很可能存在类似该热稳定性的PME。3．本实验采用盐提法从柑橘皮中提取果胶酯酶，用pH-stat法测定酶在不同温度和不同pH下的活性，得到如下结果：所提取的酶最适温度在50℃左右，且在该温度下对热稳定性好：在50℃时热处理50min后仍保有80％以上的活力。当温度高于50℃时，酶的活力下降较明显。最适pH在8左右。当pH大于8时，酶活力下降。由此表明，该酶的最适宜工作环境是50℃，pH=8。关键词：柑橘果胶酯酶基因克隆AbstractGeneCloningoforangePMESpecialtyOfFoodSciencePostg

5、mduate：YEHuaAdVisor：MaLiPectinMethylesterase(Ec：3．L1．11)，whichbelon昏tosaponifcationalenzyme，caIlrandomlyhydrolyZethemethylesterbondofpectin．Icisdistrjbutedinallofplantsandsomeofmicroorganisms．PMEisone0fenzymesthatwidelyusedinindustry，especiallyiIlbeVerageindustry．Recently，thepreparationofL

6、M。pectinbyPMEismoreandmoreregardedbysch01arS．Theresear(．hofPMEgeneishotspotoVerseas，butfreshreponsinChina．PMEindtmspeelhasbeenresearchedinthisanide．Themaillresultswereasfollows：1．PMEgenehomcitruspeelswasclonedusingRT—PCR．Weobtailledalengthof1797bpgene，anditsORFis1785bp，coding594aminOacid．T

7、11esequenceanalysisindicatedthatthisgenehas5potentiaIN一醇ycosylationsites．Signalpeptideisconsisted0f19aminoacidresidues，themostlil【elydeavagesiteislikelytosituatedinbetween45and46(VVT—II)．HydmphobicaⅡalysisi11dicatedthatbetweensites20and50isatypicalhydIophobicr