南海沉积物中酯酶基因克隆表达及酶学性质研究

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1、南海沉积物中酯酶基因克隆表达及酶学性质研究摘要酯酶(Esterase，E．C．3．1．1．X)在广义上指的是一类具有催化酯键水解或酯键形成的一类酶的总称，广泛存在于各种生态环境的动植物和微生物中。海洋具有各种低温、高温、高静水压、强酸、强碱以及营养条件极为贫乏的各种极端环境，因此从海洋特殊环境的微生物中筛选具有工业所需高效新型特性的酯酶具有广泛的开发前景。本研究从南海深海沉积物中分离得到元基因组DNA，并构建元基因组Fosmid文库，筛选克隆获得酯酶完整基因est424，长度为921bp，编码307个氨基酸，在氨基酸水平上与已经

2、发现的酯酶同源性低于85％，可能是一个新的酯酶。利用pET28系统构建酯酶重组表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，但是重组酯酶形成包涵体，因此利用伴侣蛋白系统ChaperonePlasmidSet与酯酶重组表达载体进行共转化，通过5种伴侣蛋白的优化，利用分子伴侣蛋白dnaK-dnaJ-grpE共表达，最终获得了可溶性的重组酯酶蛋白，约35kDa。利用Ni+亲和层析系统，对重组酯酶进行分离纯化，获得了单一的纯化的重组酯酶est424。利用P．nitrophenolbutyrat方法，研究重组酯酶的酶学性质。酯酶est

3、424最适反应温度为350C，最适反应pH值为8．O，该酯酶是一个中温碱性酯酶，其酶活单位为171．03U／mg。它在200C下稳定，Fe2+和Mn2+可以有效提高酶的活性，l％的Tween80和20也可以提高酯酶的活性。从海洋微生物及海洋环境中来源的重组酶，在大肠杆菌系统中容易形成包涵体，该研究利用伴侣蛋白的共表达方法解决了包涵体的问题，并且为开发和利用海洋环境来源的酯酶资源，提供了理论和方法学基石出。关键词：南海沉积物，酯酶，包涵体，伴侣蛋白，酶学性质Cloning，expressionandcharacterization

4、ofesterasefromtheSouthChinaSeasedimentmetagenomeAbstractEsteraseisagroupofhydrolasesthatcatalyzethecleavageandformationofesterbonds．EsteraseiSusuallyfromanimals，plantsandmicroorganisms．MarineenvironmentiSthenewandhugeresourceforesterase．MarineenvironmentiSextremelydi

5、verse，coldseep，hydrothermalvents，abyssalplain，oceanictrench，seamounts，oceanicvolcanoanddeep-seawhalef．allwithhigh-pressure，salinity,loworhightemperature，complexnutrientsandspeciallight．Therefore．theextrememarineenvironmentrepresentsavastpoolofnovelgenesandbiocatalyst

6、s，suchasesterase．Inthisstudy,weextractedthemetagenomicDNAfromSouthChinaSeasedimentandconstructedthefosmid1ibrary．111eesterasegeneest424wasscreenedandclonedfromthefosmidlibrary,whichWas921bpandencoded307aminoacids．Itwashomologouswiththeexistedesterase10Werthan85％atami

7、noacidlevel．西群24genewasclonedintothepET28avectorandachievedrecombinantexpressioninEscherichiacoliBL-21(DE3)．HowevertherecombinantesteraseWasexpressedasnobioactiveinclusionbody．ChaperonePlasmidSetswereusedforco-transformationwiththeest424expressionvector．Thesolublerec

8、ombinantesterase，35kDa’WasobtainedbyusingCO—expressionwiththechaperoneplasmiddnaK-dnaJ-grpE．Therecombinantesteraseest424Waspurified