烟曲霉纤维素酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

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1、国密级：中国科学院大学UniVersityofChineseAcademyofScienees硕士学位论文2013年4月g!Q望i坠2，竺圣卫!壁垒匹Q望垒塾堕￡塾垒!垒￡!旦￡鱼垒堕Q坠Q!￡曼丛坠l垦墨￡墨!至Q磐4望趔!茧堕Z丝丝i丝丝苎BvYiⅪeADissertationSubmittedtoTheUniversi哆ofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfmmentoftherequirementForthedegreeofMasterOfBiochemistryandMOlecularBiOlOgyInsti

2、tuteofMicrobiology’ChineseAcademyofSciencesApril，2013摘要纤维素的有效降解可以缓解世界能源危机，各国研究者近四五十年来一直致力于高效纤维素酶的发现。纤维素酶系主要包括：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和p．葡萄糖苷酶。其中p一葡萄糖苷酶还可以广泛应用于多种工业领域，如食品行业、饲料工业和医药领域等。烟曲霉(4妒e僖舭办m瑶r口觚)具有较好的耐热性，其产生的酶大多具有较高的热稳定性，因此是一种非常好的工业用酶来源。本研究中我们从烟曲霉中分别克隆了p．葡萄糖苷酶基因堙，和内切葡聚糖酶基因哆∥，并在大肠杆菌西砌Pr配办

3、蛔cD疗BL21(DE3)中进行表达。坛，全长为1752bp，编码一个约65kDa的蛋白，属于糖苷水解酶家族l；倒基因编码的蛋白约43kDa，属于糖苷水解酶家族9。以七叶苷为底物对重组p．葡萄糖苷酶Bgl酶学性质进行了研究分析，结果表明，该酶的最适温度为45℃，最适pH在5．5．6．O之间，为酸性酶：在pH4．7范围内具有稳定性，70℃水浴处理2h，能保持60％的残余活性。K。值为17．7mmon。。Ca2+对重组酶有轻微的激活作用，而SDS强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高，为进一步的研究与应用奠定了基础。另外，我们还对重组内切

4、葡聚糖酶E91进行了初步分析。关键词：烟曲霉，p一葡萄糖苷酶，内切葡聚糖酶，原核表达，酶学性质AbStraCtCellulaseshaVeat仃actedgreatattentionfornearlyfiVedecadesduetotheirapplicationpotendalinefIbctiVelybioconVersionofceUulose，whichcouldaUeviatetheworldecononliccrisis．Thecellulasesareminlycomposedofend091ucanases，cellobiollydr01as

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6、ialemEyme．InthisstIldy，weclonedtllegeneencodingputativep—glucosidaseBglandendoglucanaseEgl丘om一．扣聊喀口觚．Botllgeneswereexpressedin上沽c厅仃耙愚抽cD疗BL21(DE3)．111e69，geneencodesa65妨pu协tiVep—glucosidasebelongingtoG1ycosideHydrolaseFaIIlily(GH)l，and廿1e叫encodesa43l(Dpu协liveendogluc锄asebelongingto

7、GH9．nep嘶fiedrecombinantBglwasch啪cterizedusingEsculinassubs仃ate．Ourre叭nsshowedthattheop戗nmmtemperatureandpHwere45℃锄d5．O-6．0，respectiVely．ARerincubationat70℃f-or2h，t11erecombin锄tBglremained60％ofitsinitialactivi哆TheKmforEsculinwas17．7mmol／I．Ca2+couldincre嬲eenzymeactiV时slightly，whiletl

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