红曲霉丙酮酸脱羧酶基因克隆表达及酶学性质分析

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1、广东药学院硕士研究生学位论文红曲霉丙酮酸脱羧酶基因克隆表达及酶学性质分析专业：病原生物学研究生：朱碧云导师：李浩明教授中文摘要目的丙酮酸脱羧酶(Pyruvatedecarboxylase,PDC,E.C.4.1.1.1)是丙酮酸代谢的关键酶，它也能催化芳香族氨基酸前体生物转化成光活性α-羟基酮。本研究构建红曲霉cDNA文库，筛选得到丙酮酸脱羧酶PDC基因，原核表达pdc基因，分析并比较红曲霉重组丙酮酸脱羧酶与野生型丙酮酸脱羧酶的活性与动力学性质的差别。方法使用Trizol提取红曲霉的总RNA，利用

2、CreatorSMARTcDNA文库构建试剂盒构建红曲霉cDNA文库，筛选丙酮酸脱羧酶基因，利用聚合酶链反应(PCR)技术从克隆载体DNA中扩增出pdc基因。对扩增片段和表达质粒进行酶切后连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜，挑取若干单克隆菌落进行PCR鉴定，阳性克隆产物送去测序。将重组质粒pET-PDC转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜，挑取若干单克隆菌落进行2+PCR鉴定。IPTG诱导表达阳性转化菌，SDS-PAGE

3、检测目的蛋白，通过Ni-NTAagarose亲和层析纯化后进行稀释复性。将红曲霉在马铃薯培养基中30℃培养7天，收集菌体，超声波破碎细胞，离心，取上清。硫酸铵（NH4）2SO4盐析获得粗酶液，分别经凝胶层析柱SephadexG-25与DEAE阴离子交换柱纯化蛋白。SDS-PAGE检测纯度。分别测重组PDC和野生型PDC的活性，并分别分析二者的动力学性质，比较两者的异同点。I广东药学院硕士研究生学位论文结果成功构建红曲酶cDNA文库，筛选得到了红曲霉丙酮酸脱羧酶pdc基因，pdc基因的开放阅读框长1

4、713bp，编码一个570个氨基酸残基的蛋白质，其序列已向GenBank提交并被收录，序列号为HM191265。重组PDC在原核细胞E.coliBL21(DE3)中高效表达，约占菌体总蛋白的32.7%，经亲和层析纯化，重组蛋白的纯度达95%左右。偶联酶法测定该酶的活性，二者的最适反应条件均为pH6.0，30℃，在最适条件下测得重组PDC与野生型PDC比活分别为20.2U/mg、30.1U/mg；重组PDC的Km值为2.6mmol/L，野生型PDCKm值为0.56mmol/L。结论红曲霉pdc基因可

5、在大肠杆菌中高效表达，红曲霉PDC活力较高、稳定性较好，可用作生物燃料乙醇生产的候选资源。关键词红曲霉；丙酮酸脱羧酶；克隆；表达；酶学性质II广东药学院硕士研究生学位论文EnzymologicalPropertiesofNativeandRecombinantPyruvateDecarboxylasefromMonascusankaCICC5031Graduate:ZhuBiyunMajor:PathogenicBiologySupervisor:LiHaomingProfessorAbstrac

6、tObjective：Pyruvatedecarboxylase(PDC,EC4.1.1.1)isakeyenzymeinthemetabolismofpyruvate,anditcanalsocatalyzethebiotransformationofaromaticaminoacidprecursorsintoopticallyactiveα-hydroxyketones.Inthisstudy,MonascuscDNAlibrarywasconstructedfirstly,andthent

7、hepyruvatedecarboxylasegenewasscreenedfromit.TherecombinantplasmidpET-PDCwasconstructed,andtherecombinantproteinwasexpressedinprokaryoticcell.ThedynamictestandenzymologicalpropertiesofMonascusnativepyruvatedecarboxylasewerecomparedwiththerecombinantPD

8、C.Methods：TotalMonascusRNAwasextractedusingtheTrizolreagent.MonascuscDNAlibrarywasconstructedusingCreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit.Thepyruvatedecarboxylasegenewasscreenedfromthelibrary,andamplifiedusingpolymerasechainreaction(PCR)fromthe