菊粉酶基因克隆表达、酶学性质的研究和分子改造

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1、菊粉酶基因的克隆表达、酶学性质研究和分子改造摘要大力发展非粮生物质能源已成为我国能源战略的一个重要组成部分，而果糖基的非粮生物质资源如菊粉等开发利用较少；另外，利用外切菊粉酶通过一步法生产高果糖浆也具有很大的市场竞争潜力。本研究从马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)DSM5418中克隆出外切菊粉酶的成熟肽基因(尬ⅣU)和含信号肽基因(州U)，构建了表达载体pSE380一MINU(INU)、pET-22b—MINU和pPIC9K-M／NU(INU)。分别将pSE380-M／NU(INU)和pET-

2、22b-M／NU转化到大肠杆菌JMl09和BL21(DE3)细胞中，使用IPTG进行诱导表达，没有检测到菊粉酶酶活，而且SDS—PAGE检测分析也没有特异性目的表达条带，菊粉酶基因在大肠杆菌中表达失败。将pPIC9K-M／NU(INU)转入毕赤酵母(Pichiapastoris)GSll5中，实现了高效分泌表达，其中成熟肽酶活力高于含信号肽酶活，诱导表达120h酶活力达到15．27U／mL，后续工作均使用成熟肽MINU基因，进一步对重组酶进行了纯化与表征。经过硫酸铵沉淀、透析和分子筛纯化后，得到了纯度大于95％的纯化重组酶

3、，SDS—PAGE表明MINU的表观分子量为90kDa，大于理论预测值60kDa。纯酶液的表征结果表明：MINU的最适温度和最适pH分别为55℃和pH5．0，在此条件下MINU对菊粉的如值和比活力分别为1．90mmoL／L和433．86U／mg，对蔗糖的‰值和比活力分别为27．81mmoL／L和1249．49U／mg，I／S值为O．34；HPLC分析表明，酶解菊粉的产物由果糖和葡萄糖组成；金属离子Mn2+、Fe3十、K+、C02+对酶有促进作用，而Zn2+、Cu2+、Ni2+、SDS和EDTA对酶活力有不同程度的抑制作用。

4、通过已有的三维晶体结构Schwanniomycesoccidental&转化酶(PDBID为3KF5A)为模板，I-TASSER和SWISS．MODEL网站对K．marxianus菊粉酶基因进行同源建模，对D32、S124、N158、E217、Q215位点进行突变。实验结果表明，D32A矛IE217A是菊粉酶催化反应所必须的氨基酸，任何一个位点的改变都会导致酶丧失活力，获得三个有菊粉酶活力的突变子S124Y、N158S$IQ215V，与原始酶相比，Q215V的最适反应温度降低了10"C，而且最适反应pH也升高了O．5个单位

5、，S124Y最适反应pHi,

6、J降低了0．5个单位；以菊粉为底物时，三个突变酶的‰值均有所降低，而Q215V以蔗糖为底物时的％值升高了6倍，‰升高表明与底物之间的亲和力升高；突变酶S124Y和N158S的比活力都比野生酶有所提高，而Q215V的比活力有一定的降低。关键词：菊粉酶马克斯克鲁维酵母大肠杆菌表达毕赤酵母表达酶学性质分子进化CLONING,EXPRESSION，CHARACTERIZATIONANDMOLECULARMoDIFICATIONOFEXO．INULINASEFROMKLUYyERoMYcESMARⅪAN

7、USABSTRACTDevelopmentofnon-grainbiomassenergyhasbecomeanimportantcomponentofChineseenergystrategy,andfructoseradicalnon—grainbiomassresourcessuchasinulinandotherdevelopmentandutilizationless．Inaddition，theuseofexo·-inulinaseby-·stepproductionofhighfructosecronsyru

8、phasagreatprotentialforcompetitioninthemarket．Inthisstudy,themature(M／NU)andsignal(INU)peptidegenesofexo—inulinasefromKluyveromycesmarxianusDSM5418wereclonedintotheplasmidpSE380，pET-22bandpPIC9K，therecombinantplasmidpSE380--MINU(INU)andpET-22b--MINUweretransformed

9、intoE．coliJM109andE．coliBL21(DE3)．InducedexpressionbyIPTGwasnotdetectedactivity,andSDS—PAGEdidnotdetectthespecificitypurposebandtoo．Theinulinasegenesexp